热力灭菌基础

《热力灭菌基础》由会员分享，可在线阅读，更多相关《热力灭菌基础（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1. 热对活细胞的作用12. 影响灭菌效果的因素22.1 物理/化学条件22.2 相对湿度32.3 曝热时间33. 热力灭菌的对数规则33.1 灭菌机理33.2 对数规则的数学模式33.3 灭菌工艺有关参数及其相关性43.3.1 D值一微生物耐热参数43.3.2 Z值一灭菌温度系数63.3.3 F值一TC灭菌时间8T3.3.4 F值一标准灭菌时间903.3.5 灭菌率 L93.3.6 无菌标准的数学模式113.4 D值测定法123.4.1 不生长分数法123.4.2 存活曲线法133.5 对数规则在非湿热灭菌领域的应用143.5.1 干热灭菌153.5.2 干热去热原15第五篇 热力灭菌基础与

2、无菌保证中国药典200（版在通则附录XVII中收载了灭菌法，为我国制药业采用国际标准增添了新的篇章，也为灭菌的半定量控制纳入了定量控制轨道确立了法定依据。和欧美的药典一样，我国 药典收载的灭菌法中包括了湿热灭菌法、干热灭菌法、滤过灭菌法、辐射灭菌法及环氧乙烷灭 菌法。本篇只讨论热力灭菌的动力基础、无菌保证及常用灭菌设备三个方面，为读者理解热力 灭菌原理、理解无菌保证要求、选用灭菌设备、制订验证方案、实施验证等方面提供必要的基 础资料。第一章 热力灭菌基础1. 热对活细胞的作用热力灭菌是研究最深、使用最广的灭菌方式。当温度超过细胞最佳生理活动的温度范 围时，随着温度的升高，细胞代谢减缓，细胞的生

3、长及繁殖最终停止。每种细胞的生理活 动的温度均有一上限，一旦温度超过它的上限，起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久 性破坏，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。从微观上看，不具备真正核膜结构的原核细胞（如细菌和蓝绿藻）耐热性最强。某些嗜 热性细菌甚至可在80C以上的高温中存活。但是，绝大多数生长态菌在80100C下即可 被迅速杀灭。具备核膜结构的真核微生物，如真菌和原生动物，在6080C下就可被迅速 杀灭。多数病毒的耐热较差，只有乙肝病毒（HBV）例外，它要在75C下至少曝热3分钟才能 被灭活。还有一些其它类型的生物体也具有较强的耐热性。例如，痉挛性假麻痹症*的蛋白侵袭 子（prion）病原体，它

4、既不属细胞型微生物也不属病毒，需要在132C下加热一小时才可 完全杀灭；而在细菌中，需氧菌中的芽孢杆菌属（Bacillus）和厌氧菌中的梭状芽孢杆菌属 （Clostridiui）也具有较强的耐热性。这些细菌的细胞能产生内源性孢子（芽孢）或胞间 休眠体，一旦形成这种状态，它们对热、干燥及化学消毒剂的耐受性增强。要想杀灭这类 芽孢，使之下降一个数量级（对数单位），干热灭菌的温度必须达到100170C，湿热灭菌 的温度在80129C之间。如以干热灭菌及湿热灭菌的灭菌率L（lethality）来计算，芽孢 被杀灭困难的程度比其生长态时增大了104105倍。细菌芽孢的耐热性与多种因素有关，有些因素尚没被

5、人们完全认识。芽孢形成时，细 菌停止生化反应，并将遗传物质包藏在芽孢中。此过程中发生了一系列生理变化：细胞质 大量脱水，体积变小，在变小的原生质体周围形成了一层厚壳，此过程中，还生成了一种 特殊化学物质一吡啶二羧酸或DPA （吡啶-2,6-二羧酸）。在芽孢形成阶段，吡啶二羧酸钙 能与脱氧核糖核酸（DNA）以及细胞内的酶形成复合物，从而对休眠状态的芽孢起保护作 用。处于休眠状态的芽孢可以存活很多年，在适宜的条件下，它们在数分钟内即可恢复到 生长状态。* Creutzfekldt-Jakob ，克罗伊茨费尔特-雅各布综合症，一种罕见的、有传染性的致命性脑病。2. 影响灭菌效果的因素2.1 物理/化

6、学条件在细菌形成芽孢过程中的多种环境因素会影响孢子的耐热性。例如，温度较高并有二 价阳离子（如Ca2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+）存在时，芽孢的耐热性增强；与此相反，当pH值超 出6.08.0的范围时，或在高浓度的盐水或磷酸盐中形成芽孢时，其耐热性下降。自然界中芽孢的耐热性与环境条件相关，如溶液浓度、水份（相对平衡湿度a ）、pH 值、对芽孢有损伤作用的物理因素以及对芽孢有抑制作用的化学品等，它们均会影响芽孢 的耐热性。包藏在晶体或有机物内的芽孢，其耐热性通常明显高于一般非包藏态的芽孢。因此， 在某一温度条件下，将泥土包藏性芽孢和从泥土分离并培养得到的芽孢同时灭菌时，要想 获得相同的灭菌效

7、果，同一灭菌温度下，前者所需的灭菌时间比后者要高出十多倍。由于 被灭菌品受到了泥土中芽孢的污染，如在运输处理中被未经过滤空气微粒所致的污染，或 者由人员或其它物品接触遭受污染时，要将芽孢完全杀灭会很困难，正因为如此，GMP要 求采取一切必要的措施防止污染。2.2 相对湿度在热力灭菌中，水对杀灭细菌芽孢起着重要作用。与水相关的灭菌方式只有两种：湿 热和干热。湿度达到饱和相对湿度（RH）为100%（或a =1.0）时的灭菌方式称为湿热灭 w菌；相对湿度低于100%条件下的灭菌方式统称干热灭菌。实验数据表明，温度在90 125C之间，相对湿度在2050%时，细菌芽孢较难杀灭；当相对湿度高于50%或低

8、于 20%时，则较易杀灭。这对选择灭菌条件具有指导意义。2.3 曝热时间灭菌过程中，原核细胞的死亡（被杀灭）遵循一级反应的规则。温度与某一时间芽孢 存活对数间的关系，在许多情况下呈线性。这就是说，在特定的灭菌温度下，任一时间孢 子死亡仅与这个时间孢子的浓度相关，而使孢子数下降一个对数单位所需时间并不受孢子 原始浓度的影响。本篇第二章中将对此作专门讨论。3. 热力灭菌的对数规则3.1 灭菌机理组成细胞的蛋白质分子的功能取决于它的特殊结构，在一定高温条件下受热,蛋时白质分 子内氢键发生断裂影响了分子空间构型的重排，从而导致微生物的死亡。对这一课题进行的大 量的研究表明，细菌孢子，尤其是芽孢杆菌和梭

9、状芽孢具有耐热性。耐热孢子的破坏取决于在 水份条件下孢子的水合作用以及核酸和蛋白质的变性。因此，蒸汽灭菌中使用饱和蒸汽是至关 重要的。饱和蒸汽的穿透性比干热空气及过热蒸汽的穿透性要强得多。蒸汽冷凝时放出的（潜54热0 卡/克）传给被灭菌品，使之升温并使被灭菌品所带的微生物尤其是表面微生物发生水合作用， 从而加速了他们的死亡2。3.2 对数规则的数学模式长期以来，人们进行了大量的探索及研究工作，以解决蒸汽灭菌无定量标准的难题。研究 的对象主要是耐热孢子，因为生长态菌在灭菌过程中很容易被杀灭。研究的课题是在蒸汽灭菌 过程中，微生物的死亡（被杀灭）所遵循的规律。研究的结果表明，将活的微生物看作反应物

10、， 并将杀灭后的微生物看作生成物，孢子的死亡基本符合质量作用定律。因为这一研究以阿伦尼 乌斯一级反应为基础，故被认为是经典理论。湿热灭菌的对数规则始于921 年BigeoW发表的论文-用对数规则阐述灭菌工艺过程，Rahn 等人对此进行了详细的研究3，使对数规则更系统化了。按照他们的理论，灭菌时微生物的死 亡遵循对数规则，灭菌过程可以用阿伦尼乌Arrhenius的一级反应式来描述。根据质量作用 定律，在恒定温度及保持其它条件不变的情况下M立时间内被杀灭的微生物数正比于时原有0 的数目，即：dN/dt=K（NNk） （2）0式中：N为t=0时，存活的微生物数；0Nk为t时被杀灭的微生物数；N为t时

11、存活的微生物数。如果把普通座标换成半对数座标，则可得到一直线，见图.4将积分得到：LgNt=LgN0（K/2.3O3）t图5.1微生物存活数与灭菌时间关系图图5.2微生物存活数对数与灭菌时间的关系3.3灭菌工艺有关参数及其相关性3.3.1 D值一生物耐热参数系指一定温度下将微生物杀灭0%或使之下降一个对数单位所需的时（分）。D值的大小直 观地反映了微生物的热耐受性，中国药典附录灭菌法中耐热参数的提法由此而定。有的学者曾 将D值译作九成杀灭时间，内涵并无差异。按D的定义，将t=D, Nt =1/1ON代入式并化简：0（K/2.303）lgN lgN tJgyNXlglAlD=-2.303/K即，

12、D是直线方程（3）斜率的负倒数。D值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌 中就越难杀灭。对某一种微生物而言，在其他条件保持不变的情况下值随灭菌温度的变化而 变化。USP24攵载的生物指示剂嗜热脂肪杆菌B.s tearo thermophilU的孢子在121C下的D值在1.5-3分钟之间。不同温度下，不同的微生物在不同的环境条件下具有各不相同的 这可以从表4.1.2汇总的数据看出。表5.1.2不同灭菌温度下的值4微生物名称温度。C介质D值份)嗜热脂肪杆菌105葡萄糖87.8嗜热脂肪杆菌110葡萄糖32.0嗜热脂肪杆菌115葡萄糖11.7嗜热脂肪杆菌121葡萄糖2.4嗜热脂肪杆菌121葡萄糖

13、乳酸林格氏液2.1嗜热脂肪杆菌121注射用水3.0梭状芽孢杆菌105葡萄糖1.3梭状芽孢杆菌105注射用水13.7梭状芽孢杆菌105注射用水2.13.3.2 Z值一灭菌温度系数Z值系指使某一种微生物的值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数。在灭菌温度不大的变化范围内，温度和D的对数值之间可设定为线性函数。于是有:lgD =lgD+S(T-T)(4)2 1 2 1式中：S为Slop为方程(4)的斜率；D 及D分别为T和T度下的D值。1 2 1 2不难看出，Z是直线方程(4)斜率的负倒数，即：Z=(TT)/(lgD-lgD)1 2图5.5 Z值定义图不同的微生物孢子，在不同的溶液中有各不相

14、同值。同种孢子的Z值在不同溶液中亦有差异。表1.3列举了嗜热脂肪杆菌在不同溶液中的 值。表5.1.3嗜热脂肪杆菌在不同溶液中的值5溶液Z值葡萄糖水溶液10.3注射用水8.4葡萄糖乳酸林格氏液11.3pH7磷酸盐缓冲液7.6平均9.4在没有特定要求时，值通常都取10,以简化计算。Z值被用于定量地描述孢子对灭菌温度变化的敏感程度值越大，孢子对温度变化的敏感性越弱，此时，企图通过升高灭菌温度的方式来加速杀灭微生物的收效就不明显。这可通过下 表及按表所作的图4.1.8来理解。不同Z值下，D121=1.5的孢子在不同温度下的值表灭菌温度CZ=7CZ=10CZ=12CD/mimlgDD/mimlgDD/m

15、imlgD105300.002.47760.001.78832.611.51311057.691.76118.991.27812.401.09311510.971.0335.970.7764.750.6761202.080.3181.890.2761.820.2601211.500.1761.500.1761.500.176按表中数据，可得值与灭菌温度关系图。图5.6 Z值与灭菌温度关系图如果Z=10C，贝iJ110C下的D值为18.9盼。Z=7C时，直线的斜率增大，此时值升到57.6分钟。当Z=12C时，情况正相反,D值降至12.38分钟。当灭菌温度上升时，这三种微生 物孢子相应）值变化幅度隠值的增大而减少的趋势是显而易见的。3.3.3