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1、免疫组化简要步骤1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等 除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附,然后置于清水中清洗， 除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右），再将载玻片浸泡于酒精之中，然后 放到架子上，置于379温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多 数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石 蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变 成固态。3. 切片：将包埋好的
2、组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左 右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5口m,如果比较难切，则可以 适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40C温水中。4. 捞组织：当组织载玻片置于40C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受 热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时，一般取载 玻片的下1/3或者下1/2 一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常 捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致， 以便观察，再将捞
3、出来的载玻片置于架子上，放入37C温箱中烘干。5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80% 酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放 10mi n,天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话，就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15mi n.6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性 的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2,在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸 煮3min （中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸
4、煮的 目的是为了使抗原的位点暴露出来。7. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中 5min,洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来， 然后放入37C温箱中半小时。血清稀释10倍（900MPBS： 100口1血清封闭液）。8. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加 一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4C冰箱中保存过夜。9. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min,擦干组织周围的PBS 后加上二抗，然后置于37C温箱中半小时。10.
5、加SABC:将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min,擦干组织周围的PBS 后加上SABC,然后置于37C温箱中半小时oSABC稀释100倍（990ylPBS： 10ylSABC）。11. 加显色剂:将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min,擦干组织周围的PBS 后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀，然后加1滴显色剂B, 摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀）A： DAB B： H2O2 C：磷酸缓冲液12. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为 半分钟，植物组织3-5m in。13. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒 精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二 甲苯中，搬到通风柜中。14. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一 侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
