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1、编制说明一、任务来源根据国家认证认可监督管理委员会的标准制（修）订计划安排，行业标准燕窝的分子生 物学真伪鉴别方法（计划编号为2007B149）,归口国家认证认可监督管理委员会，由中国检 验检疫科学研究院负责起草工作。二、编制本标准的目的和意义燕窝是由雨燕科金丝燕及同属类的唾液凝结而成的物质，是一种名贵的保健食品。由于 燕窝的营养价值较高,消费者对其需求日益增长。而燕窝是一种稀缺资源，世界贸易统计每年 收获的燕窝总重量只有大约2000 吨。正是在这种供需矛盾和巨大经济利益的驱使下，燕窝市 场的掺假掺杂现象十分普遍,造假材料主要包括银耳、猪皮、琼脂、果胶、蛋清等，使消费者 蒙受损失。目前缺乏燕窝
2、质量相关的检测标准，十分有必要开展燕窝产品真伪鉴别方法研究 并进行标准化，以保证燕窝市场的规范化运行1， 2。三、编制原则本标准的编写是按照GB/Tl.l-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则 的要求进行的。本标准是在“十一五支撑项目”功能性食品有效成分检测和鉴伪技术的研究 的基础上制定的。期间参考了大量国内外相关文献，通过多次实验和反复论证，吸收借鉴国 内外相关经验，在遵循标准科学性、实用性和可操作性的原则基础上，确定了燕窝产品真伪 鉴定的实时荧光PCR和双向电泳检测方法标准。四、国内外文献调研情况目前燕窝的鉴定方法很多，如表面特征、溶涨性、泡沫、染色、灼烧等简单的物理方法
3、微观形态的显微观察方法，蛋白质含量、紫外吸收、氨基酸组成、唾液酸含量、多糖组分等 仪器分析方法。但上述方法存在一些缺陷，例如燕窝是唾液腺的分泌物,不存在明显的组织细 胞特征,因此显微鉴别的结果可靠性不高；燕窝理化鉴别的物质基础在于其粘蛋白,虽有一定 的特异性,但由于伪品在制造过程中往往加入一定量的蛋清做粘合剂 ,故理化鉴别专属性不 强；红外光谱法存在样品取样均匀性问题；气相色谱法是以寡糖链成分为分析基础,形成燕窝 的单糖指纹图谱以作鉴别，但在生物合成过程,糖蛋白中的糖链是通过糖基转移酶从核苷酸糖 将单糖顺次地装配到已形成的糖链受体上 ,最终生成的糖链结构不但决定于每个糖基转移酶 的专一性,而且
4、也受到肽链结构和形成异头键能力的影响,故糖链的合成过程不是模板化的, 可以终止不同阶段,因而糖链结构普遍存在微不均一性。这种微不均一性会影响鉴别结果的可 靠性1，2，3，4。相比于上述方法，电泳鉴定是以燕窝所含水溶性蛋白质为分析基础,已经证明燕窝的蛋白 质是燕窝药效的物质基础之一。因此,理论上电泳中蛋白质谱带的位置、显色的深浅可很好地 反映燕窝的真伪和质量,但由于燕窝蛋白富含唾液酸,影响其电泳分离效果。本方法采用的双 向电泳法，结合了等点聚焦和 SDS 垂直电泳技术，明显增强了蛋白质分离效果。另外，实时 荧光 PCR 法已被广泛应用与物种鉴定，可用于燕窝制品中燕窝成分的快速检测。五、主要技术内
5、容（一）材料与方法1、样品种类及来源4 份燕窝样品（苏普官燕、云南白燕、瓜目官燕、瓜曼官燕）由浙江杭州胡庆余堂保健品 有限公司提供，另有 5 份燕窝样品（白燕盏）由广东检验检疫局技术中心提供。葱、大豆、 胡萝卜、黄瓜、鸡、鹿、米、木瓜、牛、芹菜、土豆、兔、西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、 银耳等 19份样品购自市场。2、主要试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、7cm预制pH 4.7-5.9梯度胶条、100X两性电解质（pH 4.7-5.9, pH 6.3-8.3）、蛋白质纯化试剂盒、水化上样缓冲液、胶条平衡缓冲液I、胶条平衡缓 冲液II、低溶点琼脂糖、蛋白质分子量标准、矿物油、DTT、碘乙酰胺
6、、考马斯亮蓝G250、 过硫酸铵等购自美国伯乐生物公司；Nucleospin食品DNA纯化试剂盒购自香港基因公司； SYBRgreen MasterMix试剂盒购自北京欧比特公司。3、主要仪器设备 等电聚焦仪、恒温水浴锅、冷冻离心机、微量移液器、垂直板电泳仪、超声波破碎仪、天 平、凝胶成像仪、真空浓缩仪、冷冻干燥仪、荧光PCR仪。4、DNA 提取将样品粉碎，称取40mg样品粉末，按照试剂盒说明书提取核酸DNA提取和纯化，产物溶于50pL水。5、实时荧光 PCR采用SYBRgreen MasterMix试剂盒，按照25卩L体系配制反应液，其中模板体积5卩L。引物及反应参数如表1， 2所示。表 1
7、 检测用引物名称序列目的基因Cfib5端引物5- TGAATTGAGCCTGTCGTCTG -3纤维蛋白原基因Cfib3端引物5 -TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3NA5端引物NA3端引物5- ATTCGAAAAATCCTGGCCTT -35- CATTGGGGTTTTTGTTCAGG -3NADH脱氢酶表2实时荧光定性PCR反应循环参数作用时间/s温度/C去污染12050活化DNA合成酶和预变性60095PCR （40个循环）变性1595延伸6060变性反应（1个循环）变性1595复性2060变性1595最后两个步骤之间升温时间设为最大值6、蛋白质提取将样品充分研磨，称取500
8、mg于50 ml离心管中，加10 ml水，4C放置24 h, 1000 Xg 离心10分钟，吸取800卩L上清于1.5ml离心管中，共6管。真空离心浓缩3 h,液体缩减至 约200卩L。使用蛋白纯化试剂盒进行蛋白除盐，冷冻干燥后用300卩L上样缓冲液溶解，具体 操作是通过超声破碎辅助，用上样缓冲液依次溶解所有6管蛋白。12000Xg离心5分钟，取 上清进行等点聚焦。每个样品制备两份蛋白上清，同时进行等电聚焦和SDS-PAGE。7、等电聚焦将IGP胶条于室温放置10分钟，沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入蛋白样品。在 槽两端1cm左右不要加样，中间样品液保持连贯，去除气泡。用镊子去除IPG胶条
9、保护层， 轻轻将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上，使胶条正极对应于聚焦盘正极。去除气泡。 在胶条上覆盖3ml矿物油。盖上盖子，设置等点聚焦程序:水化50V 12 h,线性250V 30 min， 快速500V 30 min,线性4000V 3 h,快速4000V 至20000Vh,快速500V任意时间。聚焦结束后，立即进行平衡和第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于水化盘中-20C保 存。8、垂直电泳配制10%聚丙烯酰胺凝胶（7cmX7cm）。将聚焦好的IPG胶条胶面朝上放在干的厚滤纸 上，另将一份滤纸用水浸湿，直接置于胶条上，吸干胶条上矿物油和多余样品。将胶条放置 于水化盘中，加入
10、2ml平衡缓冲液I,缓慢摇15min，取出胶条，竖立在滤纸上去除多余液体, 将胶条放置于水化盘中干净的槽中，加入平衡缓冲液II，摇15min，同法吸取胶条上多余液体， 将胶条胶面朝上放在聚丙烯酰胺凝胶的长玻璃板上，用少量热的低溶点琼脂糖封胶液滴在玻 璃板上，同时使用镊子，轻轻将胶条推入凝胶胶面，不要在胶条下放产生气泡。同时在分子 量孔中加蛋白质分子量标准品。用封胶液封闭胶条。凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。加电 泳缓冲液，进行电泳，电压设置为50V 30min, 100V 3 h,至溴酚蓝指示剂到达底部。9、染色与成像电泳结束后，轻轻撬开玻璃，取出凝胶，用固定液固定2 h,再用染色液染色3 h,
11、用 脱色液脱色至背景干净。用凝胶成像仪成像。使用双向电泳图像分析软件将图谱转换成高斯 图谱。（二）实验结果1.实时荧光 PCR 法特异性燕窝DNA提取存在一定难度，采用常规方法往往需要较大的样品量（500mg-1g）,不 便于操作，而且 DNA 质量不理想，扩增效率低。我们采用 50mg 样品量，对两份燕窝标准样 品分别采用CTAB 法, Wizard磁珠试剂盒和Nucleospin试剂盒法提取DNA后进行Cfib扩增， 发现只有 Nucleospin 试剂盒法提取的 DNA 扩增出目的条带，产物明亮，且无非特异条带，表 明 DNA 质量良好。M DNA 分子量标准（从上至下为 600，500
12、，400 ，300 ，200，100bp）1, 2. CTAB 法；3, 4 Promega Wizard 试剂盒法；5, 6 Nucleospin 试剂盒法；7.空白对照。针对燕窝纤维蛋白原基因和 NADH 脱氢酶基因分别设计引物，通过筛选得到 Cfib 和 NA 体系。如图 2， 3 所示，两个引物均显示良好特异性，而且双引物的应用有助于提高检测准确 性。由于燕窝产地不同，品种不同，因此需要对不同产地来源燕窝样品检查引物的涵盖范围 如图 4， 5 所示，两个引物对9 个燕窝样品均得到 Tm 值一致的信号峰。Melt Peak Chart : Data 2009-03-301145.opdl
13、p、(nLL-lx)p,Temperature, Celsius芹菜、土豆、兔、Melt Peak Chart : Data 2009-03-30 1145.opd芹菜、土豆、兔、100500-50-100箭头指示燕窝DNA，其余信号峰来自葱、大豆、胡萝卜、黄瓜、鸡、鹿、米、木瓜、牛、西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、银耳等 19 种样品。西瓜、鳕鱼、鸭、羊、玉米、猪、银耳等 18 种样品。Melt Peak Chart: Data 2009-04-24 1050.opd图4 9个不同产地燕窝样品的NA体系溶解曲线gtroo100o-1006065707580859095图5 9个不同产地燕窝样品
14、的Cfib体系溶解曲线2.实时荧光PCR法灵敏度图6是Cfib体系的灵敏度实验结果，可检测到0.5%的燕窝/银耳混合物。NA体系具有相同的灵敏度。ILI25OO50o O o O5 O1 1PSLL.E-? 1图 6 Cfib 体系的灵敏度箭头指示 0.5%燕窝/银耳混合物3. 燕窝双向电泳图谱特征图7是9份燕窝标准样品的双向电泳图谱。图8是最常见的掺假物银耳和燕窝混合物的双 向电泳图谱。燕窝图谱的特征包括1）蛋白点为集中分布在图谱中央位置的2-4行平行的蛋白点 群（椭圆形和方形标识的模式）；2）蛋白点分子量集中在41KD-28KD； 3）蛋白点等电点基本位 于4.7-5.9中间以及偏酸位置。
15、银耳燕窝混合物图谱显示含50%银耳的样品能明显检测到掺假 物蛋白（虚线标识）， 20%的样品图谱中掺假物蛋白较弱，但尚能识别。因此，本法对银耳的 检测灵敏度可达到 20%。另外，应当看出，不同产地和不同等级燕窝的图谱有一些差异，主 要表现为蛋白点的深浅，数量，等电点方面，反映了不同品种金丝燕的生物属性的差异以及环境和制备方法导致的燕窝品质的差别，但由于不同燕窝样品的图谱都具有明显的共同特征 因此局部的差别不仅不会对真假燕窝的判断带来影响，而且为不同产地和不同等级燕窝之间 的鉴别提供了丰富的信息。MMM图 7 燕窝标准样品双向电泳图谱5.9 M曲云南白燕白燕盏1白燕盏4占燕盏5白燕盏3瓜目官燕苏普官燕白燕盏2瓜曼官燕MMM 蛋白分子量标准从上至下为： 194KD、 104KD、 57KD、 41KD、 28KD、 21KD、 16KD。50%银耳/燕窝端银耳/燕窝PI4.7.5.9PI4.7图 8 银耳与苏普官燕混合物的电
