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1、无菌工艺验证指导原则1 概述无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般涉及注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药品应完全不具有任何活的微生物，但由于目前检查手段的局限性，绝对无菌的概念不能合用于对整批产品的无菌性评价，因此目前所使用的“无菌”概念，是概率意义上的“无菌”。一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（SterilityAssuranceLevel,SAL）来表征。而这种概率意义上的无菌保证取决于合理且通过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及生产过程中严格的GMP管理。无菌药品通常的灭菌方式可分
2、为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizingprocess）和无菌生产工艺（asepticprocessing）。其中最终灭菌工艺系指将完毕最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。部分或所有工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则重要对在注射剂与无菌原料药的生产中比较常用的湿热灭菌与无菌
3、生产工艺进行讨论。本指导原则中的湿热灭菌工艺验证重要涉及灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确认等内容；无菌生产工艺验证重要涉及无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统的验证等验证内容。最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应当达成的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率10-6，非最终灭菌无菌产品的无菌保证水平至少应达成95%置信限下的污染概率0.1%。由此可见，非最终灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励公司
4、在生产中采用隔离舱等先进技术设备。基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌保证水平符合规定，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的灭菌方式，并系统地评估生产的各环节及各种因素对无菌保证水平的影响，根据风险的高低与风险发生的也许性等来针对性地验证灭菌工艺的可靠性，验证的内容、范围与批数等取决于工艺与产品的复杂性以及生产公司对类似工艺的经验多少等因素。只有在研发中通过系统而进一步的研究与验证，获得可靠的灭菌工艺，并在平常的生产过程中严格执行该工艺，才干真正保证每批药品的无菌保证水平符合预期的规定。当然，在药品的整个生命周期内，随着对所生产的药品的特性和生产工艺等
5、的了解越来越全面和进一步，灭菌工艺也在不断的完善，此时就会涉及到对变更后的工艺如何进行验证的问题，本指导原则也合用于此种情况。由于灭菌/除菌工艺验证的工作在我国开展的时间不长，基础还不牢固，因此必然在实际工作中会碰到很多难以预料的问题，故本指导原则只是一个一般性原则，药物研发者应从药物研发的客观规律出发，具体问题具体分析，必要时根据实际情况采用其他有效的方法和手段。同时，本指导原则作为阶段性产物，必将随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研究与验证的认知加深，而不断进行修订与完善。2制剂湿热灭菌工艺2.1湿热灭菌工艺的研究2.1.1湿热灭菌工艺的拟定依据灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树（详见附
6、件1）进行，湿热灭菌工艺是决策树中一方面考虑的灭菌工艺。湿热灭菌法是运用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。高温在杀灭微生物的同时，也许对药品的质量也有所影响。假如产品不能耐受湿热灭菌，则需要考虑采用无菌生产工艺。所以，对于药品的灭菌工艺的考察和拟定，一方面是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌的高温。目前湿热灭菌方法重要有两种：过度杀灭法（F012）和残存概率法（8F012）。用其它F0值小于8的终端灭菌条件的工艺，则应当按照无菌生产工艺规定。以上两种湿热灭菌方法都可以在实际生产中使用，具体选择哪种灭菌方法，在很大限度上取决于被灭菌产
7、品的热稳定性。药物是否能耐受湿热灭菌工艺的高温，除了与药物活性成分的化学性质相关外，还与活性成分存在的环境密切相关，所以在初期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析，以拟定能否采用湿热灭菌工艺。2.1.1.1活性成分的化学结构特点与稳定性通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性，假如活性成分结构中具有一些对热不稳定的结构基团，则提醒主成分的热稳定性也许较差。在此基础之上，还应当通过设计一系列的强制降解实验对活性成分的稳定性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下也许发生的降解反映，以便在处方工艺的研究中采用针对性的措施，保障产品可以采用湿热灭菌工艺。2.1.
8、1.2处方工艺的研究在对活性成分的结构特点与稳定性进行研究的基础上，可以有针对性的进行处方工艺的优化研究。如活性成分易发生氧化反映，则需要考虑是否需要在工艺中去除氧并采用充氮的生产工艺，或在处方中加入适宜的抗氧剂；如活性成分的稳定性与pH值相关，则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性的pH值，当然此时需要关注该pH值在临床治疗时能否接受；假如主成分是由于某些杂质的存在影响了稳定性，则需要通过适宜的手段去除相关的杂质；假如是主成分在某种溶剂系统中稳定性较差，则需要考虑更换溶剂系统，此时同样需要考虑所选用的溶剂系统在临床应用时能否被接受；湿热灭菌的不同灭菌温度和灭菌时间的组合对产品的稳定性的规定有所
9、不同，可以在保证提供所需的SAL的基础上，通过灭菌时间和灭菌温度的调整来拟定药物可以耐受的湿热灭菌工艺。总之，需要通过各个方面的研究，使药物尽也许的可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论和实践均证明即使采用了各种可行的技术方法之后，活性成分仍然无法耐受湿热灭菌的工艺时，才干选择无菌保证水平较低的无菌生产工艺。2.2.1.3稳定性研究无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。考察最终灭菌程序对产品性质稳定性影响的实验可涉及产品的降解、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品的其它质量特性。灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却的变化将影响产品的稳
10、定性，同时影响杀灭效果。因此，稳定性研究用样品最佳选取处在最苛刻的灭菌条件的产品，如：可采用在热穿透实验中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以保证灭菌产品的质量仍能符合规定。2.1.2过度杀灭法的工艺研究通常来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需的被灭菌品开始生产阶段和平常监控阶段生物负荷的信息较少，但是过度杀灭规定的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的也许性增大。过度杀灭法的目的是保证达成一定限度的无菌保证水平，而不管被灭菌产品初始菌的数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121值大于0.5分钟。因
11、此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，从技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。假如实际生产中可以严格遵循GMP的规定，这一点是可以实现的。2.1.3残存概率法的工艺研究与过度杀灭法相比，残存概率法方法所需的信息量要大得多，涉及被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段的信息、指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的实验菌）以及生物负荷的信息。只有积累了这类有价值的信息后，才干制定比过度杀灭法F0值低
12、的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会减少。使用热力较低灭菌程序更有助于药品的稳定性，使产品的有效期延长。正是由于这个因素，残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。通常说来，不耐热药品的灭菌也许不能使用过度杀灭法，需要设计一个灭菌程序可以恰本地杀灭生物负荷，同时不导致产品不可接受的降解。这种情况下，灭菌程序的确认就需研究产品的生物负荷和耐热性。根据以下公式可以比较清楚的说明这一点：无菌保证值=F0/D-lgN0其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生物总数，D为污染微生物的耐热参数。所以，菌工艺的无菌保证值与F0、N0、D密切相关。2.1.3.1灭菌前生
13、物负荷的控制采用残存概率法进行终端灭菌的产品，除了需要关注灭菌过程自身，还需要在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体的措施通常涉及灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等等。灭菌前微生物污染水平的监测将在下面的章节具体阐述。产品过滤在终端灭菌的产品中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺拟定的过程中，也应当对滤膜的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物的特性，通常在药液放置期间也会逐渐繁殖，特别一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有助于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和验证来拟定溶液
14、配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前可以放置的最长时限，并相应拟定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。2.1.3.2灭菌前微生物污染的监测灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充足考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，假如灌装连续一段时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下的方法：先用灭菌的5%吐温充足湿润0.45um的滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营养琼脂平板上，在3035下培养37天，计数。分离获得的污染菌需要进行耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用以下的测
15、定方法：先用灭菌的5%吐温充足润湿0.45um的滤膜，然后过滤污染水平监测所取的药液样品，再将此膜移至装有无菌的待监测产品的试管中，在沸水浴上煮沸约30分钟，然后在30-35下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观测是否有耐热菌生长。当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定期煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再测试耐热污染菌的D值（D值的具体检测方法详见附件2），然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。2.2湿热灭菌工艺的验证湿热灭菌工艺的验证一般分为物理验证和生
16、物学验证两部分，物理验证涉及热分布、热穿透实验，生物学验证重要是微生物挑战实验。物理验证是证实灭菌效果的间接方式，而微生物挑战实验则直接反映灭菌的效果，两者不能互相替代。2.2.1物理确认2.2.1.1空载热分布实验空载热分布的目的是重要是了解整个灭菌设备的运营情况，确认灭菌室内的温度均匀性，测定灭菌腔内不同位置的温差状况，拟定也许存在的冷点。空载热分布实验通常采用足够数量的热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室的不同位置。温度探头的安放位置需要根据设备类型和不同位置下的灭菌风险评估而定，应涉及也许的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处，其他的探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度的检测具有较好的代表性。温度探头在实验前后至少需要两个温度点进行校正。
