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1、HSP47在肾小管上皮细胞转分化中的作用与机制研究 密级分类号博士学位论文.:.,:二.在肾小管上皮细胞转分化中的、。吐作用与机制研究 研 究生 :毕慧欣学科专业:内科学,原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明。作者签名: 日期:五墨竺 丝贮年月上日关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保
2、留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者虢聋鳖导师签名谶嗍脚月手日中文摘要博士学位论文要摘研究背景肾间质纤维化 ,是慢性肾脏疾病,进展到终末期肾脏疾病,的共同通路和最主要病理改变之一。大量动物及临床实验表明,在各种原发和继发性。肾脏疾病中,肾间质纤维化程度比肾小球硬化程度与肾功能的关系更为密切,是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标。肾小管上皮细胞转分化,是肾间质纤维化的早期且可逆阶段,细胞外基质,沉积是肾间质纤维化的主要,组织学改变。研究表明转化生长因子.
3、一在这一过程中起关键作用。./.信号通路是.诱导肾小管上皮细胞及沉积的主要途径。热休克蛋白 ,是热休克蛋白家族的一种胶原特异性分子伴侣,能与多种类型的胶原和前胶原特异性结合,调控胶原的表达,在多种器官纤维化过程中起重要作用。研究显示过度表达与肾脏纤维化密切相关,并成为肾脏纤维防治的目标之一。主要表达于表型转化的肾小管上皮细胞,受.调控,抑制表达能够减轻肾脏纤维化。肾小管上皮细胞过程中伴有热休克蛋白亚族的产生,而热休克蛋白参与的研究目前尚不多,基于以上分析,我们认为可能与慢性肾脏疾病肾小管上皮细胞及沉积有关。因此,本实验从体博士学位论文中文摘要内体外两方面研究肾小管上皮细胞中的作用,并进一步阐述
4、其可能的作用机制。博士学位论文 中文摘要第一章在模型大鼠中的表达及其对肾小管上皮细胞转分化的影响目的 阐明在模型大鼠肾小管上皮细胞及沉积中的作用,探讨以为靶点抑制肾小管上皮细胞及沉积的策略。方法周龄雄性大鼠,体重、。随机分为假手术组组、模型组组、模型超声联合脂质微泡反义寡核苷酸,组组以及模型超声联合脂质微泡正义寡核苷酸,组组。每组只,再随机分为天组,天组,天组三个亚组每组只。按分组于第、和天处死大鼠,取结扎侧肾脏。运用、染色观察各组大鼠肾脏组织形态学改变,采用免疫组化方法检测组大鼠不同时间肾脏组织、波形蛋白、紧密连接蛋白 .,.、型胶, 的表达,运用 及?原检测各组大鼠天时各组大鼠肾脏组织、.
5、、的表达。结果和染色显示,与组相比,组大鼠.随梗阻时间延长,肾小管损伤程度、间质纤维化程度及炎症细胞浸润逐渐增加.。与组相比,组上述病变程博士学位论文 中文摘要度较同时间组减轻.,组无明显差别.。免疫组化显示,与组相比,组大鼠随梗阻时间的延长肾脏组织、表达上调.,而.表达下调.。与组相比,天时组蛋白及表达明显降低.,同时.蛋白及、表达上调., 蛋白及表达下调.,纤维化程度减轻;组、.、蛋白及表达无明显变化.。结论模型大鼠肾小管上皮细胞及沉积过程中,表达上调;抑制表达能部分逆转肾小管上皮细胞,抑制生成。关键词 肾间质纤维化,细胞外基质,超声微泡转染,上皮细胞间充质转分化中文摘要博士学位论文第二章
6、在肾小管上皮细胞中的表达及其对.诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响沉目的 阐明在.诱导的一细胞积中的作用,探讨以为靶点抑制.诱导的细胞及沉积的策略。方法用/ .刺激细胞一组,通过及. 检测、细胞免疫荧光、.的表达,通过 及. 检测型胶原,和型胶原,的表达;转组及阴性对照组染砌峪.组,阴性对照为无基因抑制效果的一段,检测表再予.刺激,通过细胞免疫荧光、.达,通过 法检测细胞、.、的表达变化。和结果/ .刺激后,一细胞、蛋白及呈时间依赖性表达升高.,.蛋白及呈时间依赖性表达降低.,而蛋白及也呈时间依赖性表达升高.。与?组相比,组细胞蛋白及表达明显下调.,同时和.蛋白及表达上调.,、蛋白及表达下调.;
7、一组、中文摘要的蛋白及表达无明显变化.。导.细胞及沉积过程中伴有可部分逆转细胞,抑制,肾小管上皮细胞,上皮细胞间充质转博士学位论文 中文摘要第三章通过调节的活性参与.诱导的肾小管上皮细胞转分化目的阐明参与调控.诱导的肾小管上皮细胞及沉积的可能机制,为靶向防治肾脏纤维化提供理论依据。方法用/ .刺激细胞.组,通过方法检测细胞中、的表达水平;转染组及阴性对照组对蛆一组,阴性对照为无基因抑制效果的一段,再予.刺激,通过方法检测、的表达变化。结果促进磷酸化,上调/表达.,在分钟时达到峰值,随后稍下降,在小时达到另一峰值。与.组相比,组蛋白表达下降.,同时/表达下调.;一组/表达无明显变化.。结论?诱导
8、.细胞表达上调;通过调节的活性参与调节.诱导的肾小管上皮细胞及的生成。关键词.,博士学位论文 英文摘要 . . . /?,. ?,?, . ?.? .博士学位论文 英文摘要 .,.博士学位论文 英文摘要.。 ,一 , ?, . .,.,. ,一一, . , .,博士学位论文英文摘要.,.,. , ., ,一., 博士学位论文 英文摘要 ?一 一 .一 ./ ? ,一, , 一.,一 .一 ,一, ?,.一, , 一., ? .,一 .一, ., ,博士学位论文英文摘要. 一,.一 .一 , ,博士学位论文 英文摘要 ? . ./ ? ., ., ,. 一 , 一/.,/.?一 .,博士学位论文
9、英文缩略词英文缩略词表缩写词热休克蛋白上皮细胞间充质转分化 慢性肾脏疾病终末期肾脏疾病细胞外基质 肾小管基底膜 单侧输尿管梗阻肾间质纤维化指数 结缔组织生长因子一转化生长因子.型受体. 型受体.血管紧张素细胞因子 .紧密连接蛋白纤维粘连蛋白 型胶原胎牛血清四甲基乙二胺糖基化终末产物过硫酸铵达尔伯克必需基本培养基 二甲基亚砜辣根过氧化物酶? ? .平滑肌肌动蛋白?冰冻切片包埋剂一人近端肾小管上皮细胞博七学位论文 英文缩略词寡核苷酸 热休克因子血尿素氮肌酐 牛血清白蛋白十二烷基磺酸钠磷酸盐缓冲液.氨基.乙基咔唑.纤溶酶原激活物抑制物.基质金属蛋白酶抑制因子信使核糖核酸碱基对脱氧核糖核酸焦碳酸二乙酯
10、苏木素.伊红?化学发光自显影聚偏氟乙烯三羟甲基氨基甲烷链脲佐菌素乙二胺四乙酸免疫组织化学肌成纤维细胞小干扰目录博士学位论文目 录中文摘要英文摘要?英文缩略词表目录?论文正文第一章在模型大鼠中的表达及其对肾小管上皮细胞转分化的影响.材料与方法?.结果?.讨论?.小结?第二章在肾小管上皮细胞中的表达及其对.诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响.材料与方法?.结果?.讨论?.小结?第三章通过调节的活性参与?诱导的肾小管上皮细胞转分?比?.材料与方法?.结果.讨论.小结?全文总结?”参考文献述综致 谢攻读学位期间主要研究成果博士学位论文 第一章第一章在模型大鼠中的表达及其对肾小管上皮细胞转分化的影响肾间质
11、纤维化 ,对是各种原因所致慢性肾脏疾病 ,进展到终末期。肾脏疾病的共同途径和主要病理改变之一【】。由于目前缺乏有效防治措施,这些慢性肾衰竭患者最终需要透析或肾移植治疗。据统计,目前全世界慢性肾衰竭的发生率以每年%速率递增【,给家庭和社会造成了巨大的经济负担。因此,研究肾间质纤维化的发生机制及治疗策略,对阻止或延缓慢性肾脏疾病的进展,防止肾衰竭的发生、减少医疗费用、保障人类身体健康具有十分重要的意义。肾小管萎缩、间质淋巴、单核细胞浸润和在慢性肾脏疾病中总是相伴出现,三者关系密切,互为因果【。以间质成纤维细胞,过度增生活化、细胞外基质 ,过度沉积为特征。活化的是间质中合成的主要细胞,其来源包括肾脏
12、固有的,循环,骨髓祖细胞以及肾小管上皮细胞间充质转分化等。其中,是最主要的来源之一。是指肾小管上皮细胞在病理情况下所处的环境改变,维持生理功能的细胞因子之间失去平衡,保持上皮细胞形态的基因表达受到抑制,表达表型的基因得到释放,肾小管上皮细胞基底膜 ,受到破坏,细胞失去其原有上皮细胞特征转变成间充质表型。有研究表明肾小管是一个逐渐进行的过程。包括:上皮细胞失去黏附特性,起细胞间黏附作用的.钙黏蛋白?、紧密连接蛋白 .,.等表达减少;间充质标识如成纤维细胞特异性蛋白.,.、波形蛋白、.平滑肌肌动蛋白【.,.等表达增多;肾小管基底膜断裂;细胞迁移和侵袭能力增加个步骤【酬。许多细胞因子,参与了肾间质纤
13、维化的病理过程。其中转化生长因子. ,.在成纤维细胞增殖、上皮细胞转分化以及细胞外基质合成降解等多个环节起重要作用,是组织纤维化过程中始发的促纤维化因子【,引。因此博士学位论文 第一章对抗.的作用以阻止肾脏疾病的进展有重要意义。但由于.信号通路的复杂性和多效应性,目前仍无理想的干预策略。热休克蛋白,是一种定位于内质网,分子量为的胶原结合糖蛋白,参与多种类型前胶原在内质网内的加工、折叠、聚合和分泌等过程,起质量监控作用,防止应激时未折叠和错误构型的前胶原产生和分泌【】。已经证实的过度表达与多种胶原异常沉积性疾病密切相关,在肾脏病领域内参与肾间质纤维化【、腹膜纤维化【】、肾小球硬化【、糖尿病肾病【
14、习等多种疾病的进展。生理状态下,生物体内存在一定程度的表达,主要参与胶原的正常合成。病理状态下,肾小球硬化及间质纤维化部位出现大量表达的细胞,主要是异常增生的表型转化细胞,如.阳性的间质细胞及肾小球系膜细胞,结合蛋白阳性的肾小球上皮细胞以及阳性的肾小管上皮细胞【?。这些表型转化细胞是分泌胶原蛋白的主要细胞,均存在高表达,这种与胶原表达的一致性除与的胶原特异性分子伴侣功能相吻合外,同时也提示可能与细胞表型转化存在一定关系。单侧输尿管梗阻 ,大鼠模型是研究肾脏间质纤维化的典型动物模型。模型大鼠随梗阻时间延长肾间质增宽、大量胶原蛋白沉积、肾小管扩张及大量炎症细胞浸润,病变肾间质区域内胶原与表达同步明显增加,进一步说明了胶原沉积与
