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1、发酵工程技术实验指导书适用课程：发酵工程技术目录实验一 酵母菌的分离和纯化1实验二 果酒制作及酒精度测定3实验三 乳酸菌的分离和鉴别6实验四 酸奶制作以及感官鉴评9实验五土壤中产醋酸菌种的分离筛选11实验六 发酵型虾酱的生产实验及氨基酸态氮的测定13 实验一 酵母菌的分离和纯化一、实验目的应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理大多数酵母菌为腐生，其生长最适pH为4.56，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性
2、条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。三、实验材料及试剂 1、成熟葡萄或苹果等果皮2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200 g并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。（3）在115条件下高压灭菌20分种。 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：
3、原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。 4、0.1%美蓝染液：0.1g美蓝溶于100mL蒸馏水中。 5、生理盐水四、主要仪器设备高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml的无菌吸管、18*180mm试管、培养皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。五、实验方法l、接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装100mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分搅拌后，用无菌移液管吸取1mL接入到9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置2830，培养24小时。（每组转
4、接3支试管）2、加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液1mL，注入另一管9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置2830再培养24h。3、镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原，菌体不着色。4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取0.1mL加富培养液到平板中，涂匀后2830培养24h。5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。 6、 镜检：挑取单菌落
5、，制片观察形态。7、 挑取单个纯菌落，每组转接3支斜面试管，备用。六、实验结果的观察及记录时间观察并记录试管1试管2试管31第一次接种后观察试管内培养液的情况2加富培养后观察试管内培养液的情况镜检培养液内菌的形态结构粗略判断是否为酵母菌3分离纯化后观察培养皿内菌落形态七、实验注意事项1、配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸。2、灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。3、接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种
6、工具的消毒。实验二 果酒制作及酒精度测定、实验目的 了解果酒酿制原理并掌握苹果酒酿制技术。二、实验原理 果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。 本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。三、实验材料及试剂 1、菌种：已分离纯化的酵母2、药品试剂蔗糖，亚硫酸钠，果胶酶，柠檬酸苹果汁培养基：粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13Be，酸度
7、0.5%以下）1000ml，K2HPO4 0.1g，MgSO47H2O 0.1g，配好后，加热煮沸35分钟，静置10小时以上，过滤、分装三角瓶和试管，115灭菌20分钟。四、仪器设备1mL、10mL吸管、300mL三角瓶（发酵缸）、果汁分离器、离心机、接种环、酒精灯、无菌超净台、恒温培养箱、显微镜、电热鼓风干燥箱、糖度计、菜刀、案板、载玻片、盖玻片、电子天平、烧杯、高压蒸汽灭菌锅等。五、实验步骤（一）酒母培养 1、菌种活化（一级种）：按无菌操作法取一环酵母菌接种于装有10mL 灭菌苹果汁培养基的试管中，混匀后置2830下培养25天，镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。2、母发酵剂制备（二级种）：接1
8、2mL一级种于装有100mL苹果汁培养基的三角瓶中，于28下培养23天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。3、生产发酵剂的制备（三级种）：方法与母发酵剂相同，一般采用300mL的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1/23/5的果汁培养液，灭菌冷却后，按10接种量接入母发酵剂，在2528下培养2448h，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。 （二）果酒生产 工艺流程如下：果胶酶、Na2SO3、柠檬酸 苹果分选清洗破碎压榨粗果汁过滤除果楂、苹果酸、丹宁 离心活化酵母母发酵剂生产发酵剂 澄清果汁 蔗糖 发酵除渣后发酵原酒操作要点：1、分选：取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。2、清洗：清
9、水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。3、破碎：为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。用破碎机破碎至果块粒度0.5cm3左右，并除去果籽。4、压榨分离：破碎后立即进行压榨分离，分离出的果汁中不得夹带果肉。然后加入0.10.15g/L的果胶酶和果汁量0.02的亚硫酸钠。混合均匀后静置20min。5、离心：转速3000r/min，离心10min。6、澄清果汁：用柠檬酸调整总酸含量为5g/L左右，蔗糖调整糖度含量为15-23%。总酸度的测定：用移液管吸取澄清果汁10mL于250mL锥形瓶中，加50mL蒸馏水，置电炉上加热至沸，取下待冷却后加入2滴酚酞指示剂摇匀，用0.1mol/
10、LNaOH标注溶液滴定至终点，记录NaOH体积（mL）。结果计算：X=cV0.06405/10.00式中X总酸含量（以柠檬酸计），g/ml；cNaOH标准溶液浓度，mol/L；0.06405换算为柠檬酸的系数，即1mol/LNaOH相当于柠檬酸的质量，g/mmol； V-消耗氢氧化钠的体积，mL；10.00样品制备液取用量，mL7、前发酵：取经干热灭菌的300mL三角瓶，加入占容积的45的澄清果汁，添加35的酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在1822之间，最高勿超过25，发酵应在712天内结束。8、后发酵：前发酵结束后，迅速将酒液与沉渣分离，酒汁转入经干热灭菌的三角瓶中，进行后发酵，使残糖继续
11、分解。期间，控制品温在1822之间，不要超过25，时间1个月，即得原酒。要求残糖含量小于2gL以下，总酸（以苹果酸计）大于5gL。用酒精计测原酒酒度。酒精度的测定方法：取一清洁的100mL容量瓶，用被测试样荡洗23次。然后注满至近刻度，将容量瓶置于20水浴中2030min，用20试样补足至刻度。将试样移入500mL蒸馏瓶，用50mL冷水分3次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。将烧瓶接入蒸馏装置。用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。为防止酒精挥发，在气温较高时蒸馏，应将容量瓶浸入冰水浴中，并使应接管出口伸入容量瓶的球部。当蒸馏液体积达到容量的9598%时停止蒸馏。用少许水洗涤应接管的头端，洗液
12、并入容量瓶。塞好容量瓶，摇匀。如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。置容量瓶于20水浴中30min，并用清洁的洗瓶加同样温度的水至刻度，再次摇匀。用酒精计直接测定蒸馏液酒精度（结果仅要求达到一位小数）。五、实验结果项目色泽气味糖度酸度酒精度结果六、思考题 1、酵母菌酿酒的原理是什么？ 2、分别阐述Na2SO3和果胶酶的作用。 实验三 乳酸菌的分离和鉴别一、实验目的了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。二、实验原理乳酸细菌科属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。微需氧、厌氧或兼性厌氧，在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸
13、菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。含乳酸菌的样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。较简便的活力测定包括凝乳时间、产酸和活菌数量等指标的检测。三、 实验材料及试剂1、实验材料：市售含活乳酸菌的酸奶。2、BCG牛乳培养基：（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（B. C.
14、G）乙醇溶液1mL，80灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8（用1N NaOH或1N HCl调pH），121湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。3、生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。4、脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或者脱脂乳粉与5%蔗糖水按照1:10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115灭菌15min。5、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯6、0.1N氢氧化钠标准溶液7、1%酚酞指示剂 ：1g酚酞溶于95%酒精，定容至100mL四、仪器设备超净工作台、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、1mL、10mL移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、涂布器、载玻片、涂
