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1、肌酸激酶MM亚型测定及其临床意义上海医学检验杂志1992年第7卷第1期卜1f1,两;/L-.函符,臻,盈肌酸激酶MM亚型测定及其临床意义上海长征医院心内科(2o0003)黄高忠综述陈思聪许绍辉*审校R,/.一,肌酸激酶(CK)及其同工酶CKMB是目前公认的诊断急性心肌梗塞(AMI)最有价值的生化指标,具有很高的敏感性和特异性n.近十余年来,CKMM亚型的研究逐渐受到重视,观察AMI后发现该亚型的演变可早期诊断AMI,推测梗塞时间及判断再灌注,对于AMI溶栓治疗病例的选择,疗效和顶后的判断具有独特的价值,已成为近年来国外酶学研究的热点之一.现简要介绍如下.一,命名及理化特性1968年Kumudu
2、valli发现从人类肌肉中提取的CKMM可通过电泳区分为三个不同的区带,但未引起重视.七十年代末,Wevei.s.,3通过杂交试验证实lCKMM是山两个不完全相同的亚单位构成的二聚体,其不同的组合形成一jCKMM的三种亚型.目前命名方法尚未统一.一般根据其电泳迁移率的差异,从阳极到阴极命名为CKMM,CKMM,CKMM3(有的以C,B,A分别代替1,2,3).其亚基组成分别为:CKMM3一M2M2;CKMM2一MlM2;CKMMlM】M1.现已证实,人心肌和骨骼肌中fl,CKMM均以CKMM3的形式存在,又称为组织型或纯基因型CKMM.AMI后CKMM3随同其他生物大分子如肌球蛋白,谷草转氨酶
3、等一起从坏死细胞内逸出,经淋巴回流入血,在血中羧肽酶N(CPN)的作用下,其中一个M亚基肽链羧基末端上的赖氨酸被切除转变成CKMM.;随后另一个M亚基又经历同样变化,转变成CKMM,(可见M.和MI亚基仅相差一个赖氨酸).这三种亚型具有相同的抗原性,分子量和酶活力,8.因在生理pH下赖氨酸带正电,故其等电点不同.Hashimoto应用聚焦层析法测定的等电点CKMM3,CKMM2CKMM1分别为7.91,7.74N7.51.CKMM1的等电点最低,故其向阳极的迁移率最大.CP-N存在于E常血tHJ-f1,分了量19万,不能透过毛绷血管内皮,来见于肌肉组织或淋巴系统中I”,.&弧j_r,-
4、蔓只订CK放入In1.才龙,f:,j:且由于该反应单向进行,CKMM不断地从血巾被清除,CKMM亚型随AMI病程呈现规律性变化一12.CPN可被特异性抑制剂如苯甲酰精氨酸或e一氨基已酸所抑制.其昕介导的反应依赖于温度,时间和Ca”,在4.G这一转变几乎停止.EGTA或EDTA作为Ca”的螯合剂常用于体外防止采血后亚型的转变.二,检测方法(一)等电聚焦(IEF)法:早期研究者采用本法较多.灵敏度高,CK总活力(TCK)大于1o5olU/L即可检出Ell,13,但需用一种昂贵的二性电解质,而且长时间的高压常导致酶的热失活.本法常出现四,五条(分别命名为X和Y带)以上的区带.Guslits14分离出
5、21条区带,并按概率推论M亚基具有六种不同的结构,但尚无直接证据.Morelli3观察到这些区带均具有CK潘力,但性质不明;另一种观点则认为是二性电解质与CKMM相互作用形成的矫作物.(二)聚焦层析(CF)法睛,l6:不使用电流,故不致使酶蛋白变性失活,灵敏度也较高,但试剂昂贵.(三)免疫浸渍法:方法非常复杂,但可同时分析多个样本,能准确定量,可作为开发其1也方法时的参照.(四)高效液相层析(HPLC)法:3omin内即可得出结果,但需特殊仪器,试剂消耗量大.以上四种检测方法因费时不适于急诊需要,或因成本高不易推广,均难以成为临床普遍使用的方法.(五)电泳法:本法在一股区带电泳基础上增加电泳时
6、间或提高电压,在电泳槽巾加入一种具有类似等电聚焦作用昀特殊缓冲液(Polybuffer96)或加入n_5啡啉丙磺酸形成一种不连续缓冲体系.该法所需设备简单,操作方便,价廉,比较适合国内一般实验室开展n.缺点是灵敏度和准确性嫌不够高,检测时间稍长(2h左右).国外采用高压电泳,可将分离时问缩512min,仪器贵m实验诊断科?44?(六)单克隆抗体法:近一,二年外已研制出CKMM亚型特异的单克隆抗体.应用免疫抑制或免疫沉淀0方法测定,不需分离CKMM亚型,结果准确,仪器设备要求不高,操作简便,随时可急诊检测,目前正在临床试用,有希望普遍推广.三,临床意义(一)早期诊断AMI:AMI的溶栓疗法是近年
7、迅速发展起来的比较积极有效的治疗措施,一般要求在发病6h内开始给药,但由于早期诊断的困难,容易延误本疗法的最佳时机.致使疗效明显降低.另一方面,由于该疗法有一定出血危险,费用也相对较”,避免盲口用于怀疑AMT的病人,故迫切需要一种能早期快速诊断AMI的方法.Hashimoto3用CF法测定狗实验性AM模型的CKMM亚型变化.冠脉阻塞前血中CKMM3,CKMM2,CKMM1分别占CKMM活力的11.44.8%,22.35.5%$H66.39.6%.冠脉阻塞后1hCKMM3(除非特指绝对活力,均为百分率,下同)即已明显上升,4,11.3h达峰值49.78.0%,12.02.3h又回到梗塞前水平.C
8、KMM,的变化与CKMM3成镜像关系,故提出测定CKMM3/CKMMl比值比CKMM3更敏惑.这是由于AMI后,CKMM3释放速率明显增加,而正常血q-ICKMM绝对含量本不高,又不断被清除,故AMI早期少谴CKMM3和CKMB释放入血虽不足以引起TCK明显升高,却可使该比值迅速增高.由于其值不受绝对释放量影响,与梗塞部位和大小无关,故在小灶性心肌梗塞的诊断上可能有一定价值们.Jaffe口用免疫浸渍法测定AMI患者CKMM亚型变化,首次采血在发病3.90.4h,T-CK及CKMB均正常而CKMM亚型已发生了明显变化,CKMM3,CKMM2,CKMM1分别为68.63.0%,17.91.9,13
9、.51.6%,86的病人CKMM3/CKMM1比值超过正常上限.MullerHansenc”报告首次采血在发病2.1h,CKMM亚型正常(IEF法);发病4h,CKMM亚型先于TCKNCK-MB出现阳性改变;8hCKMM3和该比值分另U达峰值42%和4.0;27h后降至正常.Morelli“.和Wu1也作了相应的临床研究,均证实了CKMM亚型在AMI早期诊断-价值,各家报CKMM和CKMM3/OKMMI叱伍丌女I升时间,峰值时间及幅度均不.致,这与个涔问CPN的活力,供应梗塞区血管阻塞程度(可能存在梗塞前血管不完全阻塞和梗塞后自发溶栓)等因素不同和买验方左的差异有关.因此,每个实验室应有自己的
10、正常值.除AMI外,其他情兄引起的心肌或骨骼肌损伤,坏死亦可引起CKMM升高,其亚型也发生变化,因此CKMM亚型诊断AMI的特异性不高,需要结合临床,特别是随后CKMB和LDHl/LDH2比值升高作出确诊.所幸引起CKMM升高的其他常见原因如外伤,手术,心肌炎,各种神经肌肉疾病及结缔组织病均有特殊病史或表现以供鉴别.现已有学者.脚进行了CKMB亚型的研究,发现CKMB释放入血后其中的M亚基亦经历类似转化,故可分为CKMB2和CKMBl两种亚型,前者为组织型.由于AMI早期血中CKMB含量很低,对检测方法的灵敏度要求很高,若能解决,将可弥补CKMM亚型特异性低之不足.(二)有助于梗塞扩展的诊断:
11、梗塞扩展常根据TCK和CKMB再次升高作出诊断,但对于发病24h以内的梗塞扩展(如溶栓治疗后的冠脉再阻塞),这一指标并不可靠,因在其明显升高的背景下监测其再升高既不敏感也不特异.CKMMa百分率在发病后短期内即达峰值并迅速下降,AMI发病12h后其值若再次升高,可能是模塞扩展的标志,有待进一步临床验证.(三)推测梗塞发病时间:由TCK和CKMB与梗塞面积密切相关,其绝对值的高低和相对变化不能反映AMI的发病时间.CKMM亚型转化只有在酶释放入血后才发生,呈不可逆性且与时间密切相关,计算其相对变化,不受酶的绝对释放量影响,故可用于比较客观地推断AMI的起病时间.这对于无痛性心肌梗塞和频发心绞痛后
12、出现AMI者是否接受溶栓治疗具有参考价值.Panteghini等蚰认为根据一次采血印可大致推断梗塞时间,如下表所示:03CKMM1为主36CKMM3为主610CK-MMa为主1024CKMM2为主>24CKMM1为主正常正常开始升高明显升高开始下降(旧)怍力削断心肌注nj早期指标:经静0:客拴守洼常以响痛迅速缓解,ST段短期内回复至等电线,现灌注件I-戋嵩,TCK受CKMB昨值丽,Il肌f滞泣n,J尤创性描杯,而以后者较为可靠,但因影响因素较多,其敏惑性和特异性均不够高n钔,而且对于发病6h内接受治疗者,根据CKMB峰值提前判断再灌注要等到发病lO14hr后才能得出结论,这不利于未获再通
13、者接受进一步的治疗措施(如PTCA).CKMM亚型判断再灌注的理论依据是:冠脉再通后短期内大量CKMM.释放入血并较早中止释放;CKMM3在血中CPN的作用下迅速转变成CKMM2和CKMM.而消失.目前判断再灌注常用的CKMM亚型指标有:(1)CKMM3/CKMM.到达峰值时间m;(2)CKMM3%上升速率.;(3)CKMM3%下降速率们.这三个指标不能区别自发溶栓和药物溶栓.第二个指标虽认为不受溶栓成功后常存在的血管残余狭窄影响,但临床应用有一定困难.Puleo”采用第三个指标判断再灌注,与冠脉造影比较其敏感性为87%,特异性74%,总的诊断正确率为82%,该指标得出结论的时间较迟.这方面的
14、研究是今后的重点.(五)有助于梗塞面积的估计:Morelli13认为CKMM#CKMM比值与CKMMs的释放速率存在线性关系,可反映酶从坏死心肌的释放情况,该值>1.0表示CKMM3从坏死心肌持续释放:CKMM3活力达到峰值后表明其转化速率超过了释放速率,也就是快速释放的终止.CKMM3从血中消失依赖于其转化而非重分布或直接从血中清除,其半衰期(5786min,平均65rain)只有CKMMI(116154min,平均132min>的一半7J.随着些研究的深入,必将大大丰富和发展酶的代谢动?45?力学理,有助手埂塞面积酶学,特是对.n灌f音.参考文献WagnerGSetahCirculation,47:263,1973WeversRAetal:ClinChimActa,75:377,1977WeversRAetal:ClinChimActa,86:323,1978AbendscheinDRetal:CardiovascRes,18:690,1984MicheluttiLetal:ClinBiochem,20(pp):21,1987
