《下调Rictor和SGK3对PI3KAktmTOR通路抑制剂抗食管鳞癌作用的影响及分子机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《下调Rictor和SGK3对PI3KAktmTOR通路抑制剂抗食管鳞癌作用的影响及分子机制（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、下调Rictor和SGK3寸PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂抗食管鳞癌作用的影响及分子机制目的1.探讨下调Rictor表达后食管鳞癌细胞对PI3K抑制剂LY294002敏感性变化及分子机制。2.探讨SGK3的表达水平与食管鳞癌细胞对Akt抑制剂MK2206敏感性关系及机制。方法一、体外下调Rictor表达增强食管鳞癌细胞对LY294002敏感性的分子机制。1.采用CCK-8法检测LY294002对食管鳞癌细胞增殖的影响，Westernblot法检测LY294002对PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达的影响。2. 前期实验结果表明体外下调Rictor表达增强食管鳞癌细胞对LY2940
2、02敏感性,本研究中采用Westernblot检测下调Rictor表达前后PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达的变化。二、下调Rictor表达对LY294002抗食管鳞癌作用的影响及分子机制。1. 用ECa109-Rictor-shRNA和ECa109-control-shRNA细胞建立裸鼠移植瘤模型,然后用LY294002开始治疗，检测LY294002对不同Rictor水平肿瘤生长的影响,再通过H&E染色和TUNEI法检测体内细胞凋亡的情况。2.提取食管鳞癌组织蛋白,采用Westernblot检测裸鼠移植瘤中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达。三、长时间应用MK2206对食管
3、鳞癌细胞增殖的影响及分子机制。1.MK2206处理食管鳞癌细胞ECa109和EC970624h或48h,CCK-8检测MK2206寸食管鳞癌细胞增殖的影响。提取ECa109EC9706KYSE70TE-1和KYSE14C食管鳞癌细胞的总蛋白,Westernblot检测不同食管鳞癌细胞株SGK3蛋白的表达。3.2卩M的MK2206处理ECa109和EC9706细胞0h,3h,1d,3d和5d,提取细胞总蛋白，Westernblot检测细胞中Akt和SGK3蛋白表达和活性的变化情况。四、下调SGK3表达后食管鳞癌细胞对MK2206敏感性的变化及分子机制。1.三种携带SGK3-shRNA勺慢病毒载体
4、转染食管鳞癌细胞ECa109和EC9706并用嘌呤霉素筛选稳定表达ECa109-LV3-SGK3WEC9706-LV3-SGK细胞株,Westernblot检测转染效率。2.利用筛选出的下调效率最高的细胞株，通过CCK-8细胞克隆形成、流式细胞术、细胞划痕等方法探讨下调SGK3的表达后食管鳞癌细胞对Akt抑制剂MK2206敏感性的变化。3.将筛选后的细胞株用MK2206处理0h,3h,1d,3d和5d,采用Westernblot方法检测下调食管鳞癌中SGK3的表达水平后不同给药时间Akt和SGK3蛋白表达及活性的变化。结果一、体外下调Rictor表达通过削弱LY294002对Akt/PRAS4
5、0通路的激活增强食管鳞癌细胞对LY294002的敏感性。1.LY294002抑制食管鳞癌细胞ECa109和EC9706的增殖。LY294002对ECa109和EC9706两株细胞作用24h的IC50分别为:45.623.2卩M和48.031.68卩M,作用48h的IC50分别为:19.173.14卩M和16.471.22卩M2.LY294002抑制食管鳞癌细胞PI3K/Akt/mTOR通路。LY294002以剂量和时间依赖性的方式抑制PI3Kp85a,p-Akt(Thr308)和p-p70S6K(Thr389)的表达，却促进了p-Akt(Ser473)和p-PRAS40(Thr246)的表达。
6、2. 体外下调Rictor的表达后削弱了Akt/PRAS40通路的激活。Westernblot证实Rictor-shRNA下调了细胞中Rictor的表达,机制探讨发现,下调Rictor表达增强了LY294002对PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用,且抵消了其对Akt/PRAS40通路的激活作用。二、下调Rictor表达增强了LY294002对食管鳞癌肿瘤生长的抑制作用。1. 下调Rictor表达增强了LY294002抑制肿瘤生长抑制及诱导凋亡的作用。裸鼠移植瘤实验证实丄丫294002可抑制肿瘤生长,下调Rictor表达增强了LY294002对肿瘤的抑制作用；H&E染色和TUNEL吉果显示
7、下调Rictor与单独给药LY294002均能体内诱导食管鳞癌细胞凋亡，但下调Rictor后LY294002对细胞凋亡的诱导作用更强。2. 体内下调Rictor的表达后削弱了Akt/PRAS40通路的激活。体内机制与体外一致,下调Rictor表达增强了LY294002对PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用,且抵消了其对Akt/PRAS40通路的激活作用。三、MK220张时间作用食管鳞癌细胞使Akt活性降低但促进SGK3蛋白表达。I. MK2206抑制食管鳞癌细胞ECa109和EC9706勺增殖。II. SGK3在五株食管鳞癌细胞中均有表达且存在差异,在ECa109EC9706和KYSE7表
8、达水平较低，在TE-1和KYSE14表达水平较高,MK2206对两株细胞作用24h的IC50分别为25.371.40卩M和25.581.41卩M作用48h的IC50为251.05卩M和14.151.15卩2.MK2206长时间抑制Akt的活性的同时促进SGK3蛋白的表达。当用MK2206处理食管鳞癌细胞不同的时间时,随着给药时间的延长,p-Akt(Ser473),p-Akt(Thr308)和p-PRAS40(Thr246)的表达水平降低，但p-p70S6K(Thr389),SGK3和p-SGK3(Thr320)的表达水平升高。四、下调SGK3的表达通过抑制MK2206寸SGK3的代偿性激活增强
9、食管鳞癌细胞对MK2206的敏感性。1. 下调SGK3勺表达可增强食管鳞癌细胞对MK2206的敏感性。ECa109-LV3-SGK3-home-107和EC9706-LV3-SGK3-home-107对SGK3敲除效果最好；下调SGK3表达后,MK2206使食管鳞癌G1和G2期细胞数目均增加，同时MK2206卬制食管鳞癌细胞增殖、克隆形成、细胞迁移的效果更加明显。下调SGK3表达后MK2206长时间作用可同时抑制Akt和SGK3的活性。随着MK2206乍用时间的延长，p-Akt(Ser473),p-Akt(Thr308),p-PRAS40(Thr246)和p-p70S6K(Thr389)的表达水平降低,SGK3及p-SGK3(Thr320)的表达也降低。结论1.下调Rictor增强了食管鳞癌细胞对LY294002的敏感性，其机制与下调Rictor逆转LY294002诱导的Akt/PRAS40通路激活有关。2.MK2206长时间作用抑制食管鳞癌中Akt活性但使SGK3的表达升高,下调SGK3增强了食管鳞癌细胞对MK2206的敏感性，其机制与下调SGK3抑制了MK2206寸SGK3的代偿性激活有关。
