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1、分子克隆技术实验报告应用生物技术0801 2008304201308余功臣2011年5月22日说明实验是由小组成员集体完成，实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员：余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出，详见分子克隆技术实验手册附录。一将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆于pUC19载体上摘要运用碱裂解法抽提质粒载体pUC19和带有水稻目的DNA片段M812的质粒pU1301，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA的质量，用限制性内切酶BamI和Kpn
2、I处理pU1301和pUC19，将纯化的载体pUC19与回收的水稻DNA 片段M812连接后，将重组的DNA分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a并在培养皿上培养。关键词碱裂法 琼脂糖凝胶电泳检测 亚克隆 感受态细胞 重组子的转化1 前言亚克隆，即是将已经获得的目的片段进行进一步分析，或者进行重组改造等过程。其基本过程包括：（1）目的片段和载体的制备；（2）目的片段和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。本实验中的目的片段和载体均来自细菌质粒，因此细菌质粒的抽提是目的片段和载体制备的核心步骤。本实验中以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法，是1979年由Birnboim和D
3、oly设计并发表的经典质粒DNA提取方法。其核心原理是在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体会沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。在pH值为8.08.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。所抽提的质粒即用电琼脂糖凝胶电泳来检测。一般所抽提的质粒在琼脂糖胶上能够呈现三条带，因
4、为质粒有三种构型，即线状、环状、开环状。将所获得的载体质粒与带有目标片段的质粒进行重组，其包括载体及外源DNA片段的双酶切消化、目的片段的回收和载体的纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。将重组DNA导入大肠杆菌细胞一般有两种方法CaCl2法和电转化法，本实验中采用CaCl2法。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子/mg DNA。2 材料和方法2.1用碱裂解法抽提质粒2.1.1实验材料2.1.1.1菌液
5、携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。2.1.1.2培养基携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌的培养先采用含相应抗生素的LA培养基，后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5a采用LB培养基。大肠杆菌在37培养。抗生素的使用浓度：氨苄青霉素，100g/ml；卡那霉素，50g/ml。2.1.1.3实验试剂Solution I; SolutionII; SolutionIII; 苯酚/氯仿; 异丙醇;ddH2O22.1.2两种载体的抽提步骤1. 取含有所需载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上
6、涂布或划线分离单菌落，37过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37摇床250 r/min过夜培养；3. 吸取1.5ml菌液，12000r/min离心1分钟，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次12000r/min离心1分钟收集菌体，尽量将菌液倒干净；4. 加入300ml 溶液 I，振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300ml 溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 6. 加入300ml 溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；7. 12000 g离心10分钟；8.
7、 吸取800ml 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；9. 12000 g 常温离心15分钟；10. 倒尽上清，加500 ml 75乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟）11. 加40ml 灭菌超纯水溶解；12. 质粒的质量检测，-20保存。2.1.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳步骤 1.将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上，调整好梳子的高度；2.称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；3.凝胶凝固后，小心拔去梳子；4.将DNA样品与上样
8、缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中（上样缓冲液含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中；含有电泳指示剂，以指示电泳的进程）；5.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；6.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录；（上样缓冲液含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中；含有电泳指示剂，以指示电泳的进程。）2.2外源DNA片段在质粒载体中的克隆2.2.1实验材料所抽提的载体质粒pUC19和携带外源片段M812的载体pU1301；限制性内切酶：BamH
9、I和Kpn I;2.2.2 载体pUC19和外源DNA的限制性酶切及酶切效应检测（50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作） DNA 30 mlBamH I (10u/l) 1 mlKpn I (10u/l) 1 ml 10buffer 5 mlddH2O 13 ml分别取5 ml 酶切产物用0.81.2%凝胶检测酶切效果; 2.2.3 酶切产物pUC19的纯化步骤 1. 加入ddH2O 150 ml （扩大体积），加入200l氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10 min； 2. 吸出上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20放置15分钟以上；3. 12000
10、 rpm 4冷冻离心15分钟；4. 倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后BAC DNA溶于10 ml ddH2O，pUC18 DNA溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）；2.2.4外源DNA片段M812挖胶回收步骤（上海生工公司生产的柱式DNA胶回收试剂盒） 1. 通过琼脂糖凝胶将目的DNA 带与载体带分开；2. 紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA 带的胶块放入1.5ml离心管中；（注意：不含DNA 的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短DNA 暴露在紫外光下的时间）3. 按400l/100mg 胶的比例加入Binding Buffer II , 50-60C 水
11、浴中10分钟，使胶融化，每2-3分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加Binding Buffer II 的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4. 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10 柱中，放置2分钟，8000rpm离心1分钟；5. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，加入500l Wash Solution ,8000rpm 室温离心1分钟；6. 重复5步一次；7. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，12000rpm 室温离心15秒；8. 将UNIQ
12、-10 柱放入一个新的1.5ml 离心管内，在柱子膜中央加40l Elution Buffer 或水（pH7.0），室温或37C 放置2分钟；（提高洗脱温度到55C-80C有利于提高DNA 的洗脱效率）；9. 12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA 片段。2.2.5 连接反应（10l体系）： 外源DNA 4 ml目的载体DNA 4 ml10 buffer 1 mlT4 ligase (1U/ml) 1 ml 16 C 水浴保温过夜2.2.6 感受态细胞的制备及质粒的转化2.2.6.1 CaCl2感受态细胞的制备步骤1. 前夜接种受体菌（DH5a），挑取单菌落于LB培养基
13、中37摇床培养过夜（约16小时）；2. 取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；3. 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4. 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5. 4下4000rpm冷冻离心10分钟；6. 再吸取1.5ml菌液，重复操作4、5；7. 弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；8. 4下4000 rpm冷冻离心10分钟；9. 弃去上清，加入100m
14、l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 10. 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。3 结果和讨论3.1.质粒DNA质量检测3.1.1结果图1.质粒DNA质量检测图图1是质粒DNA提取后的凝胶电泳检测的图片，图中的各条带均可见表示所需质粒抽提成功，质粒DNA提取的质量一般。图片中1号为Puc19载体，图中可看到4条带，最靠近胶孔的为杂带，下边的3条带由胶孔至胶底依次为开环状质粒、线状质粒和超螺旋状质粒。图中2号为携带目标片段M812的载体pU1301，靠近胶孔有拖带现象，出现这种情况可能的原因是部分D
15、NA被降解。3.1.2结果讨论抽提质粒过程中，吸取上清时可能混入杂质，导致了1号泳道的情况，而2号泳道的降解可能是因为溶水后放置了太长时间导致，以后需要注意。3.2质粒酶切后凝胶电泳3.2.1结果 1 2 3 4 图2.质粒酶切后凝胶电泳图（1为puc19,3为pu1301）图2是质粒经BamH I和Kpn I酶切后凝胶电泳的照片，可以看出质粒的酶切都比较理想。32.2结果讨论本组在双酶切实验中质粒切割较完全，可能原因是注入酶时较谨慎，未带入多余的酶，因此酶用量事宜，未引起星星活性。此外，当底物和酶等成分均加入完全后，本组在实验中将其弹均，并进行短暂离心使其充分混匀，因此酶切结果较为理想。3.3大肠
