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1、优质腐乳毛霉生产种曲的制备摘 要 运用人工培养技术，通过单因素和正交试验，研究出毛霉生产种曲的最适培养条件，并在实际生产中进行大量检验，获得大量菌丝发育健壮、孢子数量多、杂菌污染少的毛霉种曲，进而制成孢子粉，从而提高菌种的保藏性能。结果表明，优质腐乳毛霉生产种曲的最佳制备条件为使用1：9麸皮和豆渣作为培养基，湿度为70%，在25下培养48h，再采用45-50的干燥温度、80%干燥率制成孢子粉。关键词 腐乳毛霉；种曲；培养条件；孢子数1引言腐乳是中国具有民族风味的发酵食品，有1000多年的历史1。它是用豆浆的凝乳状物经微生物发酵制成的一种十酪型产品，营养丰富，日感细腻风味独特，含有多种生理活性成
2、分及保健功能2，深受海内外人民的喜爱，许多欧美地区的人称之为中国十酪( Chinese cheese) 3。自古以来，腐乳的生产遍布中国各地，但以浙江的绍兴、杭州、江苏的无锡、苏州广西的桂林、四川的五通桥最负盛名4。20世纪50年代中期以来，由于搞清了发酵菌种的问题，腐乳的生产由自然接种逐渐转为人工接种，毛霉是人工接种法生产腐乳的主要菌种5。在前期培菌过程中，将纯培养毛霉菌孢子制成的菌悬浮液或粉状菌种喷洒在豆腐坯上培养长毛，给腐乳一个良好的“体”，并分泌蛋白酶分解豆腐乳中的蛋白质，使产品具有良好的品味6。种曲是腐乳前期发酵的种子，由毛霉逐步培养扩大而制得。种曲质量的优劣，直接影响腐乳前期发酵的
3、质量，是腐乳生产成败的关键因素之一。酿造腐乳的质量与毛霉菌种有着密切关系，然而，毛霉的生长条件要求较高，需要较低的温度、较高的湿度和充足的氧气，另外，毛霉还容易自我降解、易感染杂菌，群体中的某些个体有关遗传基因易发生变异，菌种的生产性能会逐渐下降退化。因此，必须控制菌种的传代次数，必须经常对生产菌种经常进行分离、复壮或诱变育种。就目前现有腐乳生产厂使用的菌种来看，不太理想的占多数。主要原因是：由于技术条件和设备条件有限，对现有菌种的分离、复壮、筛选及选育工作有一定难度，造成菌种老化、衰退、抵抗力差、酶系少、酶活低、腐乳成熟后质量不够理想7。针对以上情况，本论文运用人工培养技术，以腐乳毛霉为菌种
4、，通过单因素试验和正交实验，研究了培养条件与种曲生长的关系，着力于毛霉优质种曲的制备，以期获得大量菌丝发育健壮、孢子数量多、杂菌污染少并在生产时可以迅速适应白坯生长环境的毛霉种曲，为当地工厂的生产提供优良的生产菌种。同时，试验还研究了种曲的干燥条件，将种曲进一步制成孢子粉，延长菌种的保存时间更好防止杂菌污染，并且在使用时可以迅速活化并适应工厂的生产环境。2实验部分2.1实验材料2.1.1实验原料菌种：腐乳毛霉，由高要协和腐乳厂提供。毛霉斜面培养基：PDA培养基。三角瓶培养基：豆渣、麸皮、水等。2.1.2实验仪器设备全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS SII）
5、、洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2FD）、微电脑控制生化培养箱（广东医疗器械厂，LRH-150-）电热恒温干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司，DHG-9070B）电炉、酒精灯、接种钩、试管、250mL三角瓶、烧杯、500mL容量瓶、托盘等。2.2菌种的分离纯化2.2.1PDA培养基的制备材料：去皮马铃薯：200g 葡萄糖：20g 琼脂：20g 自来水：1000mL 制法：取无霉烂马铃薯，去皮，称量后切成小块，加水煮沸30min，用纱布过滤后加入葡萄糖和琼脂，融化后补足水分至1000mL。冷却至60时进行分装，包扎标记后置于121中灭菌30min，取出摆斜面备用。2.2.2
6、菌种的分离与纯化2.2.2.1稀释倾注分离法无菌操作，用接种钩从长满毛霉菌丝的母种试管中挑取部分洁白的菌丝体于10mL无菌水中，振摇，制成孢子悬浮液。取盛有9mL无菌水的试管6支，分别标记1、2、3用无菌吸管取1mL孢子悬浮液注入1号试管内，用吸管吸三次均匀，记为10-1。然后从1号试管内取1mL于2号试管内，通过吸管的吹吸混合均匀，记为10-2。同样从2号试管内取1mL于3号试管内，记为10-3。以此类推，直至10-6。用3支无菌试管分别吸取后三个稀释度的稀释液各1mL于三个无菌培养皿中，然后加入融化后冷却至4550的固体培养基1215mL，迅速摇匀，倒置于培养箱中培养23天8。2.2.2.
7、2斜面菌种培养无菌操作，将接种针插入原种试管内挑些菌种孢子，送入培养基试管中，轻轻在培养基表面划成S形曲线，迅速拔出接种针，两支试管口及棉塞放在火焰上消毒一次，塞好棉塞。从接种箱中取出，培养实验规定的时间。不断重复以上操作，直至分离培养出无杂菌，菌丝为白色，粗壮浓密而有力的毛霉。2.3菌种的扩大培养及种曲最佳培养条件的确定2.3.1三角瓶扩大培养工艺流程：豆渣和麸皮以不同比例混合均匀调以适合水分含量装瓶灭菌冷却接种并打散培养基保温培养观察操作过程：培养基制备：豆渣跟麸皮以不同比例混合均匀（按各研究条件配料），调节至实验所需水分含量，将材料搅拌均匀。装入三角瓶中，装量2-3cm，尽量疏松。塞上棉
8、塞，灭菌121，40min，灭菌后趁热摇散，冷却备用。接种：用接种钩挑取斜面试管种1-2块，迅速接入制备好的培养基中，置于实验所需温度的恒温箱中培养，至实验所需的培养时间。2.3.2单因素试验分析方法：通过三角瓶培养实验，以感官特性、镜检和平板杂菌检验观察毛霉的生长情况，分别研究培养基的营养配比、培菌过程中水分含量、培养温度和培养时间对种曲质量的影响。质量检验： 感官特性：优良成曲的外观成块状，内部菌丝洁白，整齐健壮，孢子丛生，无夹心，无根霉（灰黑绒毛）、青霉（蓝绿色斑点）等杂菌，无异色。具有种曲固有的曲香，无霉味、酸味、氨味等不良气味。用手指触及种曲，物料疏松，富有弹性。镜检：显微镜下观察毛
9、霉的菌丝形态及孢子生长情况。平板杂菌检验：无菌操作，将培养出来的种曲接种到琼脂平板上，25培养48h，观察是否有杂菌生长。若出现倒毛及无力软毛菌丝体，黑、绿色等的杂菌斑点或者只生长一层菌膜,则判定为杂菌污染。2.3.2.1培养基营养配比对种曲质量的影响：调配培养基，其中豆渣的含量为0%、50%、75%、90%、100%，分别在25培养条件下观察种曲的培养状况。48h后制成孢子悬浮液接种到白坯上，观察毛霉的生长状况。2.3.2.2水分对种曲培养的影响：将豆渣含量调配为90%，加入一定量的水使培养基含水量分别为55%、60%、65%、70%、75%、80%,在25下培养48h,比较不同含水量对种曲
10、质量的影响。2.3.2.3温度对种曲培养的影响：将豆渣含量调配为90%，水分含量为75%，分别在20、25、28、30下培养48h,观察并记录种曲的培养情况。2.3.2.4时间对种曲生长的影响：将豆渣含量调配为90%，水分含量为75%，在25下分别培养24h、36h、40h、48h、56h、60h、72h，观察并记录种曲的培养情况。2.3.3曲种培养条件的优化（正交试验）2.3.3.1分析方法：孢子数的测定仪器：显微镜，血球计数板，盖玻片，烧杯，毛细管，容量瓶。操作方法：样品稀释：称取精确称取种曲2g (称淮至0.002g),倒入盛有玻璃珠的250mL 锥形瓶内，加95%酒精5mL，加无菌水2
11、0mL，加稀硫酸10m，充分振摇,使分生孢子个个分散，然后用多层纱布过滤、冲洗，务使滤渣不含孢子，稀释至500mL。 制片：取稀释液1滴，滴于血球计数板的计算格上，然后将盖片轻轻由一边向另一边压下，使盖片与计数板完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余的溢出悬浮孢子液，静置数分钟，待孢子沉降。 观察计数：用低倍镜头或高倍镜头观察。由于稀释液中的孢子，在血球计数板上 处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微细螺旋，才能不使遗漏。孢子常位于大格的划线上，应一律取二边计数，而弃另二边，以减少误差。 使用1625的计数板时，只计板上四个角上的4个大格(即100个小格)。如果使
12、用2516的计数板，除计四个角的4个大格外，还需要计中央一大格的数目(即80个小格)。每个样品重复观察计数不少于2次,然后取其平均值。即为该样品种曲的孢子数。计数：500A m80孢子数（个克）= 40010000 式中:A80个小格内孢子总数，个；m样品重量，g。 2.3.3.2正交实验设计以孢子数为指标，通过正交试验确定种曲培养的最优条件。试验设计见表1。表1 优化培养条件的正交试验因素水平试验号因 素A豆渣含量/%B水分含量/%C培养温度/D培养时间/h11（90）1（65）1（20）1（40）212（70）2（25）2（48）313（75）3（28）3（56）42（75）1235223
13、16231273（50）13283213933212.4优质孢子粉的制备研究2.4.1干燥流程将洗净的托盘放于干燥箱中进行150高温灭菌1h将培养好的毛霉连同培养基经灭菌的小铁铲打散倒入托盘中摊薄并分散均匀恒温干燥2.4.2干燥温度的控制按照2.4.1的干燥流程，设定干燥温度分别为25-30、30-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-70和70-90，以30%的烘干率对种曲进行干燥，制成孢子粉，以孢子死亡情况和杂菌污染情况为指标，确定干燥的最佳温度。2.4.3干燥程度的控制将种曲的烘干率分别控制在20%、30%、40%、50%、60%，观察其制成粉末的难易程度、杂菌污染
14、情况及活性恢复的难易程度。烘干率以下面公式计算：烘干后的种曲质量烘干前的种曲质量烘干率= 100%3结果分析与讨论3.1培养基营养配比对种曲质量的影响麸皮含有适合微生物生长和利用的营养成分，经测定含有：蛋白质164，灰分65，淀粉90 ，水分13，脂肪358，镁072，磷27，铁00l，钾146，生物素210ugkg，维生素B112000ug，已经广泛应用于固体发酵的基质，作为氮源9。豆渣含有相当数量的蛋白质和碳水化合物。据资料介绍，含蛋白质(干基)34.4%，粗纤维28.15，粗脂肪13.6%，水份80% 10是一种较理想的种曲原料。为了获得更多的菌体和孢子，其纯麸皮培养基申的氮源含量可增加
15、一些。况且豆渣中的氮主要以蛋白质和蛋白质的各种降解产物的形式存在，特别是氨基酸可以直接被菌体吸收，更有利于细胞内的蛋白质合成11。实验中，将豆渣与麸皮配成不同比例的培养基，在25培养条件下观察毛霉种曲的培养情况。48h后制成孢子悬浮液接种到白坯上，观察毛霉生长状况。结果见表3。表2 培养基营养配比对种曲质量的影响生长情况豆渣的百分比含量0%50%75%90%100%种曲培养的状况24h物料结成饼状，局部有菌落物料结成饼状，有短小菌丝出现物料结成饼状，有短小菌丝出现物料结成饼状，局部布满短小菌丝，物料湿度适宜毛霉最先开始生长，物料结成饼状，表面布满短小菌丝，但物料偏湿40h菌丝细长很稀疏，孢囊个小量非常稀少，有谈谈的霉香味菌丝细长稀疏，霉香清谈，孢囊量少个小菌丝细长稀疏，霉
