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1、、药剂准备SDS-PAGE凝胶配制试剂：1、 30%Acr-Bis(29:1)100ml2、 1M Tris-HCL,PH8.8100 ml3、 10%SDS5ml4、 Ammonium persulfate (过硫酸铵)0.5克先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。可可5、 TEMED0.5 ml6、 1M Tris-HCL,PH6.815mlb、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）2ml, 1ml/管，共2管c、蛋白质分子量标准（200ul）d、SDS-PAGE电泳液（IL）由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重 复利用。（
2、不宜超过两周）e、考马斯亮染色液（250ml）f、考马斯亮染色脱色液（500ml）注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：80ml甲醇或者乙醇250ml乙酸去离子水补至1000ml,混匀，备用。二、器材准备移液枪（绿色：100-1000ul,蓝色：10-100ul,白色：2-20ul），不同规格的微 量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子三、SDS-PAGE分析操作过程：1 、配制蛋白质溶液用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。确保质量分数为35g/L。试管依 次标号1、2、3、4、5。用保鲜膜和皮筋封口保存备用。最好当天现配。2、制分离胶（即下胶层）鉴于本蛋白质的
3、最佳分离范围是10-40kD，所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。 按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。依照15%胶，5ml （打勾）一 栏。如图：注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次 用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3- 3/4。c. 紧接着，用移液枪从槽上面间隔均匀地注入1000ul （即1ml）蒸馏水以 水封，目的是使分离胶凝胶上层界面平滑。d. 在30度烘箱中静置半小时，冬天室温50min。直至分离胶与水
4、之间出现一 条平滑光亮的界面痕迹。3、制浓缩胶 按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格，依照5%胶，4ml （打双 勾）一栏。如图：2按照如下农搐配制SDS-PAGE的浓舘胶（也称堆积胶、积层胶或上层胶）：成分毗制不同体积SDS-PAGb：il|2J4心蕉饰水1.422,730%Acr-Bis(29*l)0.330.50.67IM Iris, pl 16,8038|0510%SDS0.020.030.0410%过硫酸钱问0.020.0310.04uq TEMED0.0020.0030.004a. 分离胶在烘箱中10min左右后，按上图配浓缩胶，迅速摇匀。b. 待分离胶与水之间平滑光亮
5、的界面痕迹稳定后，抬高电泳仪一侧，用移 液枪从边缘吸出分离胶上的水，尽量吸干净。c. 电泳仪放平稳后，沿着槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入浓缩胶，注 意勿打入气泡，迅速平稳地插入齿梳。d. 在30度烘箱中静置半小时。4、配样。用移液枪配合微量进样针，从每支试管中吸取15ul蛋白质溶液，加入 1-5号对应小样管，每支小样管中再加入1/5 （3ul）的上样缓冲液。在100C 沸水中煮 5min。5、加电泳液及上样 小心拔出齿梳，卸下封条。将制好的凝胶用电泳架固定至电泳槽中。注：短板朝里。若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。倒入1L电泳液，液面至短板和长板之间。每孔上样量 15ul, 即小样管中全部上样（1-5 号对应）。蛋白质分子量标准上样量 7ul。6、电泳仪接线，打开电源，稳压状态下将电压调到 180v（15min 左右），待样 品跑过浓缩胶后将电压调到 200v 至样品电泳到胶底部为止，整个过程 1.5-2.5h。7、关掉电泳仪电源，拆线。从电泳仪上拔出玻璃槽。打开玻璃板，将凝胶小心剥下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2 3h，染液可回收。8、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。第二天换脱色液2-3次。脱色4 -24h。9、将脱色液倒掉，可以用Quali ty One，或者相应的成像系统拍照、分析、估 算蛋白浓度。注：具体染色脱色等步骤见说明书。
