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1、细胞培养与药物的工程生产目录1前言2次生代谢产物的生物化学与细胞生物学2.1异喹啉生物碱合成2.2萜类吲哚生物碱生物合成2.3莨菪烷（托烷）生物碱和烟碱合成3细胞培养与次生代谢物的生产31建立高代谢物生产线3.2器官分化和次生植物产品3.3生产率的遗传不稳定4. 逾越屏障：利用分子生物学手段提高植物细胞的次生代谢物产量4.1克服代谢途径的限速过程4.2基因的转录调控和整体激活4.3次生代谢物的定性控制和生物合成目的基因的隔离4.4次生代谢物的积累和存储5. 未来展望6. 结语摘要高等植物是药用化合物的丰富来源。然而，许多药用植物，由于种植技术上的困难以及 经济上的原因，仍然只能从野外获取。药用
2、化合物要求的增加和植物可利用性的大幅减少增 加了通过替代途径生产药用化合物的压力，尤其是使用细胞/组织培养和转基因植物。此外， 优质原材料的需求也有增加。1970年之前，从细胞培养获得次生代谢物的产量普遍低于那 些从植物中获得的产量。然而，一些细胞培养可以有相当大的生产力，并在某些情况下，其 产量超过目前一些完整的植物体。目前对于操纵次生代谢产物代谢的分子和细胞生物学进展 的了解，为细胞/器官培养和转基因植物中次生代谢物的商业化生产提供了乐观的基础。我 们总结了生物碱最近研究取得的进展作为一个主要的模式并讨论控制其生产率和质量的因 素，侧重于器官分化，遗传不稳定性，代谢途径的限速酶，基因转录监
3、控机构，次生代谢物 的运输和储存。1前言高等植物产生多种化学品。迄今已确定超过25,000种萜类，约12,000种生物碱，8000 种酚类物质。这些化学物质可在植物中提供多种功能。它们抵御草食动物和病原体，套种的 竞争援助，吸引有益生物，如授粉者，并有对于非生物胁迫如紫外线的照射，温度变化，水 的状态，和矿质营养的保护作用。此外，许多植物生产的次生代谢产物被用来作为香料，染 料，芳香剂，调味剂，或人类的药品。这些化学物质中的许多还可以通过多种不同的方式促 进人类健康和丰富我们的生活。植物代谢物作为天然药物的使用有着悠久的历史，可以追溯到3500年以前，当埃及， 苏美尔，草药，中药的开发邙可斯金
4、等人，2002年）。吗啡被分离出来作为鸦片的主要有效 成分仅在200年前（1806）,止痛和退烧阿司匹林（乙酰水杨酸）通过化学合成获得，而不 是从柳树树皮中提取，只有大约100年前（1897年）。随着化学合成的迅速发展，微生物生 产的抗生素以及生物转化方法增加了现代药物的供给。然而，今天，相当大的比例的对人体 有益的产品（25%以上）源于天然，尤其来源于植物。许多药用植物由于技术种植的困难以及经济原因仍然在野外收获。这些药用植物的收获 随着自然环境的人为干扰越来越多地提出了对于生物多样性减少的关注。例如，短叶红豆杉 （紫杉），这是用来生产紫杉醇（泰素），这是一种有效的抗肿瘤药，是美国西海岸的一
5、个濒 危物种。药用化合物要求的增加和植物可利用性的大幅减少增加了通过替代途径生产药用化 合物的压力。因为植物细胞具有较高的全能性，细胞/组织培养和转基因植物被经常使用。 此外，优质药物原材料的要求也增高了，因为药用植物质量的变化和不正确的植物鉴定 偶尔会导致悲剧性后果。因此，应用生物技术的方法来生产次生代谢产物是一种有吸因力的 替代方案，特别是在转基因细胞培养方面。细胞体外培养系统有几个优点，其好处以前已深入讨论过“（Dougall,1981）。综上所 述，在受控环境中生产所需的代谢产物，与气候变化和土壤条件，微生物和昆虫等因素无关。 此外，最终质量的材料可以生产，并可以通过细胞培养条件的选择
6、和优化提高其生产力。所 建立的细胞培养系统也可用于理解自然合成所取得的产品一般都是统一性和可重复性，这些 产品是在控制条件下和可从那些比高等植物组织结构少的细胞中大量获得的。另一方面，细 胞培养系统也有几个缺点；例如，需要劳力以维持细胞培养系统各通道的顺畅，长时间的串 行可能会导致各单元格属性的改变，导致系统丢失性的污染。1970年之前，从细胞培养的报告产量一般低于那些在植物中获得的。然而，如表11.1 所示，几个细胞培养系统可以有相当大的生产力，并在某些情况下，其产量超过一些完整的 植株。还有些植物细胞培养仍然会产生一些所需的化合物。这些事实突出了在经济可行性方 面生产有用的代谢产物时面临的
7、困难。因此，目前在次生代谢物分子和细胞生物学方面取得 的进步为细胞器官培养和或转基因植物中商业化生产次生代谢物提供了乐观的基础。由于次生代谢产物的生物化学和细胞生物学代表了针对生物技术基础改善的尝试，我们 首先审查研究生物碱，重点仅用于说明目的。最简单的应用化学品的生化转换，都是现成的 使用孤立的母体，或重组，酶和细胞作为生物催化剂。更多复杂的代谢工程探索都需要额外 的生化和细胞生物学信息，以来优化生产条件。首先解决了生物化学和细胞生物学，从而直 接应用于代谢工程中。2次生代谢产物的生物化学与细胞生物学许多植物中的次生代谢产物不仅做为药品，同时也作为膳食补充剂和功能食品促进人类 的健康。植物生
8、产的重组蛋白和植物疗法同等重要。由次生代谢产物功能和结构的不同而分 为几个主要群体。萜类化合物和类固醇，这是由异戊二烯基团形成，包括抗肿瘤药二萜类紫 杉醇；抗疟倍半萜类青蒿素；薯蓣皂貳元，口服避孕药和激素类药物的前体；抗强心剂地高 辛甾苷；来至于派生莽草酸途径的苯丙醇；包括抗肿瘤药物木酚素，鬼臼毒素；生物碱是一 种含氮的碱性有机化合物，包括许多具有生物活性的化学品如毒芹碱，咖啡因，吗啡，尼古 丁，和马钱子碱等。我们这里重点研究生物碱，理由是其具有相对较高的有益的生物活性， 尤其是异喹啉生物碱，萜吲哚生物碱，和托烷生物碱，是目前正在深入研究的主题。木酚素以及单萜和紫杉醇在细胞培养的潜力的优秀评论
9、已经出版。2.1异喹啉生物碱合成异喹啉生物碱是一个庞大和多样化的生物碱约有2500组定义结构。它们包括从罂粟属 镇痛吗啡，从秋水仙中秋水仙碱，催吐药和依米丁从吐根属吐根，丰富的吐根碱，骨骼肌松 弛剂。Strychonos toxifera边沁，筒箭毒碱和抗菌化合物黄连素和血根从发散的植物物种， 包括小檗SPP。和血根碱属，其中有许多是作为药品使用。异喹啉生物碱合成开始于酪氨酸转化为多巴胺和4-羟基苯乙醛脱羧，去羟基，脱氨。 在这些早期步骤，只有酪氨酸/多巴脱羧酶（TYDC;芳香族L -氨基酸脱羧酶），酪氨酸和多 巴胺转换成其相应的胺，这种酶已被纯化和修饰。这种小的基因家族（_15基因）从罂粟（
10、第 催眠）中分离而且每个亚科已被证明有明显的发育和诱导表达模式。TYDC基因家族的成 员分为两组（TYDC1和TYDC2）在罂粟中表达差有异。在成熟的植物，TYDC2在茎和根系中存在，占主导地位。而TYDC1只在根部存在。MorphineAo&tvl岳出厂1杷acidPaditaxel (TaxcOPodophyfotoMln一些重要的药用化合物的化学结构IMorphine 吗啡 2Acetyl salicylic acid 乙酰水杨酸 3Artemisinin 青蒿素 4Paclitaxel (Taxol)紫杉醇(泰素)5Podophyllotoxin鬼臼毒素Beitierinee.g.,
11、Coptic. SferrerB-Tevahdiobabeiine oicidaeLT yd&MTYDC glXnL-DpaDapannexrk-rrTyemine -Hydfdjf|en)dseetaldyde（国卜Nd吧加泊口细芒 eOMT/OMTII hCOCYP71SA1 t悄卜T凸哗hyd修匕白尅折忧4 Ariadne）怪卜Twydrtti占诫nel-Cddairifiecnmt!%8CYP60A1IB曲电吗1i車qd临出讷电Ahaldda ft,： H,淹:CH 已白tian施in*芒 巴d, Berfiens 哎ftmfeismbfpFii忧fi.g., PpSrtSr Siin
12、rJjfertJjMSOMTuriifteCP7nA2TA3uroSARSsldiaiidineThduahsSalu&Jdinol 7-oacetaie电8 CHpOO怪卜帕帼出ami储CYP60B |Sancfuinaiwejg., Ssj呻ikftsifa, PfHwtrChips wiefCORj般卜 ScauteriEiSBBEi-RaiodineRFtelojlineISASJISl-S-Hjdrajy-L、1-各种异喹啉生物碱生物合成途径。不间断的箭头表明单一的酶转换和断箭 表明多种酶的步骤。以粗体显示相应已被克隆的酶基因。多巴胺和4 -羟基苯乙醛被NCS浓缩为（S） norco
13、claurine,这是合成所有异喹啉类生 物碱的前体。近日，NCS已被从培养的唐松杆菌SPP纯化和修饰，TfNCS基因属于PR10 家庭从T.杆菌中分离。研究还表明，从培养的黄连粳稻细胞分离的一种新型加双氧酶也促进 NCS的反应。TYDC、TfNCS和CjNCS在拟南芥或大米中的同源性表明，这些基因或者有 其他的基本的生物学作用，或者在异喹啉生物合成途径是比较普遍存在的，虽然在拟南芥或 水稻中TfNCS和CjNCS的同源性相对较低，而且并没有在水稻和拟南芥中发现异喹啉生物 碱。异胡豆苷合酶（STR）（催化萜类生物碱的关键反应）基因也被在动物和拟南芥中发现。（S）Norcoclaurine是按顺
14、序被依赖于S -腺苷蛋氨酸（SAM）的乌药碱6-o-甲基转移酶先转 换成乌药碱；再被N-乌药碱甲基转移酶转换为N-甲基乌药碱；然后由细胞色素P450羟化 酶转化为3 -羟化-N-甲基化乌药碱，最后由3 -羟化-N-甲基化乌药碱4Z - O -甲基转移酶 转化生成牛心果碱。详细的研究这些重组酶，发现其有严格的反应特异性，协调生物合成按 照一定的方式和顺序。近日有报道称，黄唐松草生物合成原小檗碱生物碱存在细胞类型特异性表达。生物合成 的基因转录酶主要富含于根茎，在根部和其他器官也有较低水平。进一步的RNA原位杂交 分析发现，转录主要发生在不成熟的内皮细胞，根中柱鞘，仅限于根茎表皮的叶原基中。这 些
15、数据和生物碱积累的分析清楚地表明，不同类型的独特细胞参与罂粟和黄唐松草合成和积 累苯甲基异喹咛生物碱。2.2萜类吲哚生物碱生物合成萜类吲哚生物碱包括约3000种化合物，包括从马达加斯加长春花中获得的抗肿瘤药长 春碱，喜树中的喜树碱，并从金鸡纳属植物中获取的抗疟药奎宁。萜类吲哚生物碱生物合成 的中间产物是异胡豆苷，这是异胡豆苷合成酶催化色胺和环烯醚萜葡糖苷开链马钱子貳。色 胺是由色氨酸脱羧酶催化色氨酸产生。虽然在长春花中单个基因响应发育和诱导表达，表现 出不同的两个基因在喜树表达谱，这表明一个参与发育控制喜树碱生产茎尖和树皮，而另一 种是在诱导防御机制。催化开链马钱子貳生物合成二个步骤中的酶都依赖于细胞色素P450:香叶醇10-羟化酶 把香叶醇转化为10-羟化香叶醇，而开链马钱子貳合成酶催化马钱子貳转化为开链马钱子貳 并显示了长春花未成熟叶表皮的具体体现。萜类化合物的前体的供应是萜吲哚生物碱生物合 成的限速步骤。除了开链马钱子貳或马钱子貳在长春花细胞中培养增加生物碱积累，香叶醇 10-羟化酶的活性也和生物碱的积累成正相关性。然而，当培养中加入外源性的开链马钱子 貳时，其与内源性的形成隔离，此时合成异胡豆苷时利用开链马钱子貳的效率降低。这一结 果也表明，代谢产物高效生物合成的重点的是适当的亚细胞定位生物合成酶和底物。这些异 戊二烯前体从非
