《10&amp#215;Genomics单细胞转录组测序技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《10&amp#215;Genomics单细胞转录组测序技术（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、lOxGenomic嘩细胞转录组测序技术lOxGenomics技术是一种单细胞RNA测序方法，该技术可实现数千个细胞的快速 高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，实现细胞群体的划 分与细胞群体间差异表达基因的检测。10xGenomics单细胞转录组测序的原理lOxGenomics 平台基于微滴的核酸条形码分配系统，该系统提供了数以百万计级的 携带唯一 DNA 条形码的微滴，通过微流控技术，首先将带有条形码和引物的凝胶珠与 单个细胞包裹在油滴（GEMs ）中。凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产 生用于测序的带条形码和UMI信息的cDNA。液滴油层破碎，cDNA扩
2、增，制备cDNA 文库，然后对文库进行测序检测，即可获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。EnzymeBarcoded! Primer LibraryDNA Cells Oil技术核心油滴包裹的凝胶珠（GEMs）该系统有75万种barcoded beads，每个bead上有40-80万探针。首先介绍（Gel bead）。Gel bead由凝胶珠和磁珠上的一段引物构成。Gel bead上连 接的引物序列包含四个部分:Illumina TruSeq Read 1测序引物、16 nt的条形码（Barcode）、 12 nt的UMI和30 nt的Poly（dT）反转录引物。TruSeq Read测序
3、引物，为一段已知的短肽核苷酸序列，用于后续的上机测 序。Barcode：有400万种Barcode， 一个微珠对应一种Barcode，通过这400万种 Barcode，可以把凝胶微珠给区分开。UMI是由随机碱基组成的一段序列，每个DNA分子都有自己的UMI序列， 在混合测序时，用于区分不同的样本。能够区分哪些reads是来自于一个原始 cDNA分子，区分基因片段是重复还是duplicatic及区分是真实的单核苷酸 多态性(SNP )位点还是PCR产生的突变。Poly(dT)VN反转录引物，是含有30个T碱基的同聚DNA片段，一般具有启动子 的作用。用于捕获有polyA尾的转录本。其能够在扩增末
4、端自动加上三个C,在反应 buffer中的TS0酶含有三个G会与c互补，完成二链扩增。测序技术流程1将样本制备成单细胞悬浮液，细胞质检然后进行细胞计数和细胞活性测定，最终 使细胞活性高于90%，细胞浓度为7001200个细胞/ “。2.取75“L Mas ter Milx细胞悬浮液、40“!的含有barcode信息的凝胶珠和280“!的 油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室，经由微流体双十字吸叉系统形成油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead-In-EMulsions, GEMs)。有效的GEMs包含凝胶珠、单细胞、 Master Mix 和油。3.收集GEMs,并将其全部混合，凝
5、胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引 物序列，细胞裂解释放mRNA, mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以 及dNTP底物相接触，在逆转录酶的作用下发生逆转录反应，产生用于测序的带有 Barcode和UMI信息的cDNA 一链，再以SMART扩增方法完成第二链合成。55TS0CC C CReverse T ranscriptionAAAAAAAAA -J Ge I k 弘a JsBeadsrGrGrGV恥阳伽伽AAAAAAAAA 一Tempate SwithTranscript ExtensionTSOCCCUMI10X Poly(dT)VNBarcodePol
6、ydT PrimerRead 1rGrGrGAaaaaaMaa aaaaaaaa 二Template Swith Oligo Priming74.cNDA片段化油滴破碎，磁珠纯化cDNA 链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。TSOBarcodecDNAAmplification5. cDNA扩增完成后，首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段，通过 末端修复、加A进行cDNA片段筛选，P7 adaptor接头连接Read2测序引物，并通过 PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文 库。TSOPSCleanup & Primi
7、ngSample Index PCRRead 2SampleIndex P7P5 Read 1Poly(dT) Vh珀rcode6. 最后构建的文库结构如下:SampleBarcodeIndex卩5Readl UMI Poly(dT)VNRead2P77. 文库完成以后，进行库检，cDNA文库库检合格后，直接在测序仪上进行测序。测序 完成之后，进行数据分析。10xGenomics单细胞转录组测序优点简单便捷：集单细胞分选、扩增、建库于一体，自动化程度高，无需人工操 作。 细胞通量高：微流体“双十字”交叉系统为8通道系统，每个通道最高可捕获 10000个细胞，8通道一次可检测样本细胞数可达500
8、-80000个。 细胞捕获效率高：单细胞捕获效率高达65%，可准确鉴别稀有细胞类型，利 于稀有样本或小细胞量类型样本研究。 周期短：理论上1天即可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库的所 有的测序准备工作。 真正意义的单细胞测序：单个GEMs捕获到多个细胞的概率极低(V0.9%/1000cells)。 性价比高：与其它单细胞测序平台相比，性价比更高。 细胞可适性高：对细胞大小(直径超过40ym细胞需要制备细胞核)及细胞 类型(组织类细胞、免疫细胞、血液细胞、癌组织细胞、神经类细胞等)无 限制。10xGenomics单细胞转录组测序缺点 只分析带poly(A)的RNA。最好在90%以上。 非全长信息：只能获得3端转录本信息。 DNA建库操作步骤较多。10xGenomics单细胞转录组测序应用 3端单细胞转录组测序 基因组组装应用 免疫组库测序 ATAC-seq 人全基因组及全外显子组测序
