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1、精选优质文档-倾情为你奉上RNA抽提步骤准备：DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，充分振荡使其溶解，放在1000ml容量瓶中静置过夜后备用。配成终浓度为0.1%，室温搅拌过夜，121高压20min，4密封保存。注：DEPC属于一种致癌物质，易挥发，要小心并在通风橱中操作，高压后就会分解，其毒力消失。(用来泡器械的不高压，用来配置试剂的话要高压)灭菌：匀浆器、手术器材（剪刀、镊子）铝箔包好，EP管、枪头（三种规格）、铝箔、纸 121 60 （120min）min；DEPC水 80 30min。其中手术器材用于提取组织RNA。（匀浆器180，120min）1. 加Trizon裂解
2、细胞：加入适当量的Trizol至细胞中（直接加入去培养液平板中后用枪吸出，亦可细胞刮下后离心去上清再加，用量约1ml Trizol每3106、cells）。贴壁细胞在遗弃培养基后，可以直接加入Trizol（按10cm2 / 1ml Trizol的比例）裂解，匀浆一定要彻底。反复吹打以打碎细胞结块，室温放置5min，使其充分裂解。（注：此时可以-80长期保存）2. 4度，12000g5min离心弃沉淀。萃取除杂蛋白：加入0.2体积的氯仿，立即剧烈摇动充分混匀。混匀后冰上放置15min。(注：禁用漩涡震荡器，以免基因组DNA断裂，造成基因组DNA污染)3. 4，12000g，离心15min，此时溶
3、液分为三层：下层的酚-氯仿，白色浑浊的中间相多为变性蛋白，水相（RNA所在相），小心吸取水相（宁可损失，也不要吸到中间相），转移至另一干净RNaseFree EP管中；一般水相的体积为Trizol的60.异丙醇沉淀：向水相中加入0.5倍体积（相对于Trizol）的异丙醇，充分混匀，混匀后置于-2012h或-8030min，4，12000g，离心5-10min；（经过此步可在管底看到白色RNA沉淀）；如果起始量大的话，可以加入异丙醇即可观察到微量浑浊，则可直接离心。弃上清，RNA沉于管底。移去上清。4. 75%乙醇（DEPC水配制）漂洗：加入0.5-1ml 75%乙醇（让75%乙醇从沉淀上缓缓流
4、过，温和震荡离心管，悬浮沉淀，7500g 5min（转速太大可能会使RNA断裂）吸去乙醇，然后用枪吸沉淀附近乙醇，再短暂离心后小心吸出剩余的液体。5. 溶解RNA沉淀：用50ul DEPC水或0.5%SDS溶解RNA样品，5560加热510min。6. 去除二级结构：将RNA放置65水浴锅5min（去除二级结构）后，迅速放至冰上（防止RNA恢复原有结构）；7. 测浓度、260/280,260/2308. 检测RNA抽提效果：1% Agarose Gel,220V（用大电流跑迅速跑完防止RNA电泳过程中降解）,待溴酚蓝跑完全胶的三分之一时，停止电泳观察结果。见下图1。9. RNA保存：-80可长
5、年保存（尽量避免放置在4，-20冰箱）。Marker D20005S rRNA18S rRNA28S rRNA图1：RNA抽提结果。亮度一般28S18S5S,如果5S rRNA条带过亮，则说明RNA有降解。注：电泳取样量为3l.RNA反转录步骤1) 取总RNA 2g，加入10mM dNTP，OligodT（0.5g/l）各1l；2) 70度加热5min，冰上放置2min；3) 在同一管中加入10Buffer 2l，RNase抑制剂1l，反转录酶（50unit/l）1l。4) 轻轻混匀后置于42，60分钟。然后置80，5分钟。RNA2g10mM dNTP1LOligodT（0.5g/l）1LTR
6、IZOL法抽提RNA准备：DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，充分振荡使其溶解，放在1000ml容量瓶中静置过夜后备用。灭菌：匀浆器、手术器材（剪刀、镊子）铝箔包好，EP管、枪头（三种规格）、铝箔、纸 121 60 min；DEPC水 80 30min。其中手术器材用于提取组织RNA实验步骤：1 取出储存于-80的组织冷冻管，置于冰浴，准备EP管并做好编号。2 取出米粒大小的组织于灭菌好的铝箔中，包好，敲碎（锤子要用灭菌的铝箔纸包好）。3 将处理好的组织转移到匀浆器中，加入1ml的TRIzol溶剂（尽量将组织全部转移到匀浆器）充分匀浆至不见颗粒状物质。4 将充分匀浆好的组织液
7、转移至编号的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈振荡后，12000rpm离心15min。5 轻轻取出EP管，小心吸取上清液转移到新的EP管（编号），约400-600ul，注意不要吸到第一液相以下的任何物质。6 加入异丙醇500ul，置于-2012h或-8030min，使RNA充分沉淀。12000rpm离心710min。7 加入75%的乙醇（DEPC水配制）500ul，洗涤后6000rpm离心35min.8 轻倒出上清液，在灭菌的纸上轻叩，盖上盖子后，稍离心。9 小心吸出剩余的液体。10 加入50ul的DEPC水溶解，可以56助溶。11 测定浓度，Nano1000实验 总RNA的提取一、总RNA的
8、提取与定量Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞
9、）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g
10、/ml，单链DNA和RNA浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。仪器和主要试剂：1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2. Trizol试剂3. 氯仿4. 异丙醇DEPC水配制5. 75乙醇6. 无RNase的水或0.5S
11、DS (溶液均需用DEPC处理过的水配制)实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37过夜，然后送至高压3次，后在80烘烤箱中烘干（或置于37中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1DEPC水中泡8小时左右，37烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。以上实验材料我们实验室都是买的Rnase-free的（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）121两小时再60烘干试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DE
12、PC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37过夜，送至高压。（2）75%乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水：无水乙醇=1：3），然后放于-20备用。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4实验方法：（一）RNA提取1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10。 b.单层培养
13、细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml Trizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)2. 将匀浆样品在室温（15-30）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤：如
14、样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8 10000g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，立即剧烈振荡15s，室温放置3 min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)5. 2-810000g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60。6. 把水相转移到新管中（如
15、要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10 min。7. 2-810000g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5 min，弃上清。9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200ml无RNase的水，-70保存。（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度Nano1000测1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2. 取RNA样品5l，用水稀释50100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3. 在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1 OD单位的单链RNA = 40g/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓
