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1、RealtimePCR操作步骤：从采样到数据处理1.采样：1.1采样前的准备：DEPC水，灭菌手术刀剪，75%酒精，2mL无RNA酶离心管，2个盛有DEPC水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染。1.2采样过程中的注意事项：采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话。当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取RNA试验用样品。取样量约100mg左右（根据RNA提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）。RNA样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者RNA保存液中）冻存，最后统一转入-70C冰箱。根据实验条件选择RNA样品的
2、保存方式，优先选择液氮保存。建议:如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70C冰箱时管盖崩开使样品损失。2.总RNA提取提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法。2.1Trizol提取总RNA的操作步骤以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用75%酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害。此外，要提前制冰备用。1）每50-100mg样品加1mlTrizol，使用高通量研磨仪研磨30s。2）研磨后样品放置5min,4C12000g离心10min，上清液转移到另一个1.5ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。3）加入200
3、此氯仿，用力摇晃15s,室温放置5min。4）4C12000g离心15min，上清液转移至另一个1.5ml无RNA酶离心管中（已冰上预冷）。5）加入500L异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，沉淀RNA。6）4C12000g离心10min,弃上清。7）加入1ml75%乙醇（DEPC水配制）,用移液器反复吸打乙醇,洗涤RNA沉淀。8）4C7500g离心5min,弃去乙醇。9）用微型离心机将EP管内壁上的乙醇甩至管底，用10山枪头吸出，打开盖子置于超净台内晾十几秒,但不能让RNA全部干透,内壁上没有水珠即可。10）根据RNA的量加入无Rnase水60-120L,轻弹管壁，充分溶解RNA，混匀
4、后分装出少许用于测定RNA浓度以及用于电泳检测。11）测定OD260/OD280值以及RNA浓度。取1此RNA用DEPC水稀释100倍，紫外分光光度计下读取RNA浓度值和OD260/OD280值（1.9-2.0之间表示RNA纯度较好，小于1.8说明含蛋白质、杂质较多，大于2.2表示RNA降解）。建议：建议使用200此的枪头转移上清液，可减少蛋白污染。可用柱式RNA提取试剂盒，推荐TAKARA公司的产品，提取速度快，无毒性，质量很好，价格比较高。Trizol推荐invitrogen公司的产品，直接从公司订购要1200元/100mL，从科昊泽订只要750元/100mL,所以可以多咨询比对代购的价格
5、。3. 反转录cDNA多用转录试剂盒进行cDNA反转录，按照对应说明书操作即可。反转录过程需在超净台中进行。Invitrogen和TAKARA的cDNA反转录试剂盒的质量很高。Invitrogen的试剂盒步骤稍微繁琐，但最后得到的终产物量多。TAKARA的转录速度快，但终产物量少。我所用过的产品Invitrogen的货号是C28025-032（50次反应），TAKARA的是PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime，货号DRR036A（200次反应），和之后用的荧光定量试剂盒可以搭配使用。建议:cDNA体系中RNA模板的浓度要一致，可用体系要求模板浓度和所测出的
6、RNA浓度计算所需加模板量和无RNA酶水的量。推荐用excel计算，并打出表格，参照表格进行加样。4. 引物PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR产物的特异性及成功与否。根据试验选择引物。做Real-timePCR的引物片段最好在200bp以下。可通过查找相关英文文献来选择引物，文献中会标注目的基因的引物、引物片段长度和在NCBI上的编号。如果引物查找不到，也可自行设计，在NCBI上查找所需基因，得到基因的碱基序列，用DNAMAN设计。确定了引物序列后，交由公司订购，获得引物后需要验证是否能用。建议：实验室所用引物主要在inv
7、itrogen公司设计，3天左右能获得引物，也可以在金维智设计引物。国内公司生产速度较快，1天左右就能完成。5RealtimePCR使用TAKARA的SYBRPremisExTaqII（PerfectRealTime）试剂盒。试剂盒的实验原理如下：SYBR?GreenI是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR?GreenI荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。PCR反应生成双链DNA，SYBR?GreenI与双链DNA结合后会发出荧光，通过检测荧光信号的强弱，不但可以检测反应体系中的DNA的扩增量，同时还能测定扩增
8、产物的DNA熔解温度。具体原理见下图:瓷引物退哦Primer1n嵌合荧光染料法原理图根据说明书中不同的荧光定量仪器对应反应体系配制不同的反应液。耗材多用96孔板（半裙边）和8联管（8联TUBE）。加样方式推荐先用无菌离心管混好除样品外的所有试剂，颠倒混匀，短暂离心，再分装到每个PCR管中，取第一管时用枪头吹打数次。分装好后，再向管中加入样本。按照说明书要求设置程序后，开始进行PCR扩增。每个样品做2-3个重复，初上手建议做3个重复，数据处理时比较好剔值。扩增结果中Ct值标准差小于0.5时表示技术重复性好。5.ComparativeDelta-deltaCt法ComparativeDelta-d
9、eltaCt法即（法，是一种常用的相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。此方法的缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。所以在正式试验开始前，必须对目的基因和看家基因做标准曲线，如果两组标准曲线的斜率之差小于0.1,那么后续实验中就可以用C法进行相对定量分析。反之，如果斜率差值大于0.1,就无法用该方法进行相对定量分析。只能优化反应条件或选择绝对定量方法进行分析。荧光定量仪器所带的软件可以给出两组标准曲线的R2值、扩增效率、斜
10、率等信息。如1actinSTANDARDSYBR4-lone2H7M1actinSTANDARDSYBR-None30.5301actinSTANDARDSYBR-None2OJ875actinSTANDARDSYBR-Nane22,5635actinSTANDARDSYBR-None22.6495actinSTANDARDSYBR-Non&22.73325actinSTANDARDSYBR-None24.79125actinSTANDARDSYBR-Tlone24.92725actinSTANDARDSYBRone24.848125actinSTANDARDSYERAIone27.497I2
11、5actinSTANDAFCSYER-Mone27.517I25actinSTANDARDSYER-None27.625StandardCurveTdiaM；KIillSlwif；JaiYhMi2Q.$M贰心火EdH：1021針1hrf-1STANDARCSYBR.-CJone25.9441hif-1standardSYBR-None2E.6701加STANDARDSYBR-Nane25,8445hif-1STANDRDSY日R-NoHt27.9535hrf-1STANDARDSYBR-Non-?27.9405hif-1STANDARDSYBR-Ilone20.020药hrf-1STAMDAF
12、IDSYBRNone29.97225hif-1STANDARlDSYBR-Flone30.06925hif-1STANDARCSYBR-Nane3Q12S125hifSTANDARDSYEJNon-32创B125ftiMSTANDARDSYBR-Non31304125hiMSTAhlDARESYBR-EJont32.730StandardCurveTlfMf：hlM弱MD4：XIMrilUfrt卿*MTFWLZIH对样品进行梯度稀释（1:5）,分别对目的基因（HIF-1）和看家基因（actin）做标准曲线。二者斜率分别为-3.159和-3.264，差值小于0.1,所以可以用C袪对两种基因进行检
13、测。进行正式试验，对看家基因和目的基因进行扩增，得到一系列Ct值。导出数据前，可以先在软件中进行数据处理。调整所有结果中同种基因阈值（Threshold）相同。根据熔解曲线（MeltCurve）剔除熔解曲线异常的数据。导出数据后，根据相对定量公式（2AA）计算每个样品基因的相对表达量。样品目的基因CtMean看家基因CtMeanCtCtcAACt2对照组X1X2X1-X2实验组Y1Y2Y1-Y2(Y1-Y2)-(X1-X2)2-(Y1-Y2)-(X1-X2)Ct=CtMean目的基因-CtMean看家基因；Ct=Ct实验组_Ct对照组；实验组和对照组的基因表达差异为2-AA数据统计方法根据试验设计进行选择。
