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1、干细胞诱导实验1 材料1.1 样品高表达ER-36的SGC7901、低表达ER-36的SGC7901和正常SGC7901。1.2 实验试剂0.25%胰酶、PBS溶液、谷氨酰胺、75%酒精、双抗、鼠尾胶原、胰岛素、上皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）。 附注：鼠尾胶原铺板方法 （1）配制0.2%醋酸溶液，经高压蒸汽灭菌后备用； （2）将鼠尾胶原蛋白加入配好的醋酸溶液(储存用浓度：2mg/ml)，放入-20冰箱储存； （3）按每平方厘米取2.5ul鼠尾胶原母液加入到6孔板（每孔底面积9.6cm2）中，使平皿含有5g/cm2的胶原，用无菌推杆将鼠尾胶原平铺在皿底，打开强风吹60mi
2、n，待干燥，然后开紫外照射过夜（也可不照紫外，干燥后立刻使用），第二天使用。1.3 仪器与设备酒精灯、吸管、吸头、止血钳、6孔板（2块）、记号笔、封口膜、废液缸、手套、口罩、三色枪头、移液器、试管架。1.4 培养基血清培养基(SSM)：DMEM培养基，其中添加了5U/L胰岛素和10%的优级胎牛血清。无血清培养基( SFM)：DMEM/ F12 (1:1)中添加5U/ L胰岛素、20ng/ml的EGF和20ng/ ml的b FGF。2 实验方法2.1 肿瘤干细胞相关亚群的分离培养和传代取SSM中培养的处于对数生长期的高表达ER-36的SGC7901、低表达ER-36的SGC7901和正常SGC7
3、901细胞，PBS液冲洗后用胰酶消化，加入SFM机械吹打成单细胞悬液并计数。以5104个/孔接种6孔培养板，放入37 、5 % CO2、95 %湿度的培养箱中培养。当培养板中7d形成细胞球后（若有必要延长至14d-20d直至成球）再培养3d-4d（根据具体情况来定，若细胞状态佳则培养4d，若细胞状态不佳则提前一天接种）后接种于SSM中，接种7d后再按照2.1的方法将消化下来的细胞接种于SFM中，循环重复实验3次。2.2 细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的由血清诱导分化收集全部第3代细胞（成球和未成球的都收集起来）做western blot检测，观察ER-36、CD24、CD44和Vim的表达。将培养
4、出的第5代细胞球用PBS液冲洗后用胰酶消化，吹打成单细胞悬液后计数，按1孔：1孔的比例将细胞接种于6孔板，用SSM培养，6孔板提前用鼠尾胶原包被，用于诱导细胞向间叶方向分化。每天用倒置相差显微镜观察其分化和生长情况。当细胞贴壁、分化并处于对数生长期时在SSM中连续传代。每代都收集1次细胞提取蛋白做western blot 检测观察ER-36、CD24、CD44和Vim的表达。2.3 鉴定肿瘤干细胞及其想间叶分化的相关标志通过Western blot方法来检测干细胞及其间叶分化的相关标志（Vim、CD24、CD44、ER-36）。2.4 细胞成球的观察内容把细胞接种于SFM中，在不同时间点用倒置
5、相差显微镜观察细胞生长情况。 12h时，除了少量的细胞贴壁外，其他大部分细胞呈悬浮状态，为球形，相互有少量粘连(图1A)。24h后，开始形成少量细胞球，约由2030个细胞粘连组成，但仍有部分细胞贴壁(图1B)。48h后，产生大量的细胞团，细胞团体积明显变大，贴壁细胞进一步减少(图1C)。72h后悬浮细胞球形态更加规则，基本没有贴壁细胞。将细胞球用胰酶消化后传代，在SFM中可再形成细胞球，如此重复，细胞总数可大量扩增。用SSM常规培养的细胞在接种后24h内全部贴壁，48h后形成单层贴壁细胞层，有少量悬浮细胞，但没有悬浮细胞团(图1D)。见到这种成球的细胞团就拍下来细胞培养实验流程图SGC7901
6、 SSM（贴壁） SFM（成球） 第一代细胞球鉴定第一代细胞球 SSM+鼠尾胶原包被六孔板 连续传代 每代取细胞鉴定第一代细胞球 SSM（贴壁） SFM（成球） 第二代细胞球鉴定第二代细胞球 SSM+鼠尾胶原包被六孔板 连续传代 每代取细胞鉴定第二代细胞球 SSM（贴壁） SFM（成球） 第三代细胞球鉴定第三代细胞球 SSM+鼠尾胶原包被六孔板 连续传代 每代取细胞鉴定细胞鉴定实验流程图1.形态学鉴定贴壁 照相 成球 照相免疫荧光检测（CD24/CD44/ABCG2/ER-36/CK18/EMA/E-cadherin/Vim/CK14）2.蛋白表达鉴定用western blot检测CD24/CD44/ABCG2/ER-36/CK18/EMA/E-cadherin/Vim/CK143.用FCM检测CD24-/CD44+细胞周期
