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1、小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤螯合剂（常用EDTA）处理，分将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF ）从机体中取出，经胰酶、 散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠（小鼠）。2. 试剂无 Ca2+和 Mg2+的 PBS（D-PBS）、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF 生长培养 基（高糖 DMEM 加 10%FBS）。3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。二具体操作1.
2、 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪 开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小 心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个 装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一 次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片 将其细细切碎。3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4弋 1500 rpm离心 5分
3、钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37弋水浴中消化30分 钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目 的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心 5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤 两次。5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数（一般8只14天的胎鼠可获得 2-3x107 细胞）。6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。8. 细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超 过五分钟），按1:5传代。9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存（冻存液要现配）。注意1. 原代培养，一定要避免污染。2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。3冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。4消化细胞时间不要过长。
