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1、实用文档大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方：液体培养基牛肉膏3.0g蛋白胨10.0g氯化钠5.0g水1000mlpH7.4-7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5 2.0的琼脂1 试管斜面与平板的制备（ 1）称量 按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。（ 2）熔化 在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。将称量好的1.8琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。（3）调 PH 在未调 PH 前，先用精密 PH 试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴
2、管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH 试纸测基 PH 直到 PH 达到 7.4-7.6 。反之用 1mol/L HCl 进行调节。（ 4）分装 将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过 1/2 加塞 培养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。（ 5）包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。（ 6）灭菌 将上述培养基以 0.1Mpa,121 ,15min 高压蒸气灭菌。（ 7）倒平板 ，取三个已消毒的培养皿， 在无菌操作台上用三角烧瓶
3、中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。（8）搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至50左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。2 接种大肠杆菌斜面种子(1) 取实验室储备的大肠杆菌 BL21 种子， 在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。(2)将接种好的斜面放入37的恒温培养箱子中培养24h。3 制备平板种子(1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1 倍，10 倍，100 倍和 1000 倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100ul) ，然
4、后在37培养箱中过夜。（ 12）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37， 170r/min 恒温振荡培养18h 作种子培养液。其后的实验中， 每次实验前从种子培养液中吸取2ml 菌液接种于新鲜灭菌的液体培养基中，37， 170r/min 恒温振荡培养.实用文档使用牛肉膏蛋白胨培养基组成成分：牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl 5g,琼脂15 20g,水 1000mL,PH7.4 7.6。具体配置步骤：1.称药品 按实际用量计算后 ,按配方称取各种药品放入大烧杯中 .牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量 ,用热水溶解后倒入大烧杯 ; 也可放在称量纸上称
5、量 ,随后放入热水中 ,牛肉膏使与称量纸分离 ,立即取出纸片 .蛋白胨极易吸潮 ,故称量时要迅速 .2.加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热 ,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量 .若配制固体培养基 ,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化 ,此过程中 ,需不断搅拌 ,以防琼脂糊底或溢出 ,最后补足所失的水分 .3. 调 pH 检测培养基的 pH, 若 pH 偏酸 ,可滴加 lmol/L NaOH, 边加边搅拌 ,并随时用 pH 试纸检测,直至达到所需pH 范围 .若偏碱 ,则用 lmol/L HCl进行调节 .pH 的调节通常放在加琼脂之前.应
6、注意 pH 值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤 ,固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤 ,以利培养的观察 .但是供一般使用的培养基 ,这步可省略 .5.分装按实验要求 ,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染.分装量 :固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜 .半固体培养基以试管高度的1/3 为宜 ,灭菌后垂直待凝.6.加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉 ) 制作的棉塞 .棉塞的形状 ,大小和松紧度要合适 ,四周紧贴管壁 ,不留缝隙 ,才
7、能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用 .要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内 ,以防棉塞脱落 .有些微生物需要更好的通气 ,则可用 8 层纱布制成通气塞 .有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.7.包扎 加塞后 ,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸 ,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞 .若培养基分装于试管中 ,则应以 5 支或 7 支在一起 ,再于棉塞外包一层牛皮纸 ,用绳扎好 .然后用记号笔注明 ,培养基名称 ,组别 ,日期 .8.灭菌 将上述培养基于 121.3湿热灭菌 20min. 如因特殊情况不能及时灭菌 ,则应故入冰箱内暂存 .9.无菌检查 将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 24 48
8、h,无菌生长即可使用 ,或贮存于冰箱或清洁的橱内 ,备用 .大肠杆菌的培养：37 摄氏度， 恒温培养48 到 72 小时， 因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。大肠杆菌/ 大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。 大肠杆菌显蓝色至紫色， 大肠菌群显红色。成份(g/L)特殊营养物质28.19.实用文档混合显色剂0.31琼脂13.0pH 6.8 0.2 25 此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。注意此培养基
9、仅供实验室使用。用法称取本品 41.5g加入 1000ml 蒸馏水，加热溶解并不停搅拌， 煮沸不要超过 1 分钟。取 1ml制备好的样品液加入直径为9cm 无菌平皿中心，倾入冷却至45-50 培养基约15ml ，混匀，凝固后，再加入一层培养基进行履盖。或冷却至45-50时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在37 的培养箱中倒置放置1-2 小时，加入适当稀释度的样品液1ml ，涂布于培养基上，361培养 18 24h 。贮存制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处，保存温度2-8 ，注意避光保存。失效干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。操作步骤1、按国家
10、标准、SN 标准、 FDA 标准或其它方法制备样品液2、取样品液1ml加入 冷却至45-50 显色培养基中混匀或涂布于平板上3、361 培养 18 24h，选用有 30 200 个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色或黄色菌落。总大肠菌群= 蓝色菌落+ 紫色菌落+ 粉红色菌落.实用文档大肠杆菌= 蓝色菌落+ 紫色菌落4 、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上，36 1培养 12-16 小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验( 本公司有生化鉴定管套装20支 x3 种 )质量控制1 、外观此干燥培养基的粉末均匀， 具有良好的流动性， 呈淡红色。 制备好的平板呈透明粉红色固体培养基。2 、微生物试验在 36 1 培养 18 24h 小时：质控菌株ATCC生长情况菌落颜色单增李氏菌27853-/+无色金黄色葡萄球菌25923-/+无色大肠杆菌25922+蓝色沙门氏菌+无色大肠菌群+粉红色.实用文档方法的局限性本培养基鉴定 大肠菌群 / 大肠杆菌，少数情况下可能会出现假阳性，但不会出现假阴性，有时可能需做其它补充试验。典型特征大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色菌落。.
