细胞固定化综述及实验报告

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1、1 细胞固定化技术1.1 细胞固定化技术概要1.1.1 固定化细胞1固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的新技术，即一项利用物理或化学手段 将游离的微生物（细胞）或酶，定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用 的技术。由于固定化细胞保持了细胞的生命活动能力，它不但比游离细胞的发酵更具有优越 性，而且比固定化酶有更多的优点，因为固定化细胞省去了制备酶或含酶细胞处理过程 所需要的完整酶系.并能不断产生新酶及其所需的辅助因子，而且固定化方法较简单，成 本也较低。1.1.2 固定化细胞的优缺点2固定化细胞主要具有6个优点：一是不需要将酶从微生物细胞中提取出来并加以纯 化，酶活力损失小、成本低

2、。二是细胞生长停滞时间短，细胞多、反应快，抗污染能力 强，可以连续发酵，反复使用，应用成本低。三是酶处于天然细胞的环境中，稳定性高。 四是使用固定化细胞反应器，可边加入培养基，边培养排出发酵液，能有效地避免反馈 抑制和产物消耗。五是适合于进行多酶顺序连续反应。六是易于进行辅助因子的再生， 因而更适合于需要辅助因子的反应，如氧化还原反应、合成反应等。当然，固定化细胞也存在一些缺点，主要表现为：必须保持菌体的完整，防止菌体 的自溶，否则会影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶的分解作用；由于细胞内有多 种酶存在，往往有副产物形成。为防止副产物必须抑制其他酶活力；细胞膜或细胞壁会 造成底物渗透与扩散的

3、障碍。1.2 固定化细胞的特性21.2.1 形态学特征固定化细胞多为球形颗粒，但也有制成立方块或膜状的。用吸附法时，则取决于吸 附物质的形状。在球形固定凝胶内，细胞的分布并不均匀，而是接近于球的外表面。有 时细胞会在凝胶内的小泡中繁殖，直到最后充满整个可利用的空间。1.2.2 生理学特征固定化细胞必需具有生命活力，因此创造良好的细胞载体或基质，选择恰当的固定 化方法和生物反应器，最佳的反应溶液和周围微环境，维持细胞适度的生长和繁殖等尤 为重要。如果生长繁殖过度，容易使细胞泄漏出来，增加扩散障碍。破坏固定细胞的载 体或基质。1.2.3 理化环境特征固定化细胞的微环境对固定化细胞活力的发挥有很大的

4、影响。如丙乙烯醇已经用于 降低固定化细胞内水的活度，水的吸附程度并影响微生物细胞的吸附。固定化细胞的呼 吸生长速度、扩散速率以及代谢作用等。1.2.4 生物膜的动力特征研究结果表明，微生物细胞首先吸引到物体表面，继而分泌出黏性高分子物质，将 细胞牢固地黏附在牡体表面上。此后，继续由微生物细胞刂泌一些化合物，逐渐形成微 生物膜。2 实验方案2.1 实验目的2.1.1理解固定化细胞技术的原理方法和意。2.1.2 掌握用海藻酸钠制备固定化酵母细胞的方法。2.1.3 掌握用斐林试剂比色泔测定还原糖的方法。2.2 实骈原理2.2.1 细胞固定化原理固定微生物细胞的原理是将微生物细胞利甠物瀆的或化学的方法

5、，使细胞与固体的 水不沶性攏持牉（科称载体）癸结合，使 既不溶于水，又胭俜持微生物的活性。它在 固相状态作用于底物，具有离子交换跄脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或 装柱形式与底物溶液接觢。由于微生牡细胞被固定在载体上使弗它令在反应结杏后， 可反复使用，也可贮存较长时间使微生物活性不变。细胞固定化的方法按多种，如吸附法、载体偶联法和包埋法等。工业上常用包埋法 固定微生物细肞。本次实验采用包埋法对酵母进行固定。1 、包埋法指将微生物细胞均匀地包埋在氰不溶性载体皀紧密结构中，细胞不至漏出而底物和 产物叮以进入咄渗出。细胞咄载体不起任何结合反应，细胜处于最佳生理状态。因此， 酶的稳定性高，活

6、力持久，所以目前寱于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。2、海藻酸钙凝胶囚定酵母细胞 根据包埋剂的特怣，可以分为海藻酸钙凝胦包埋法、角叉菜聶包埋法、聚丙烯酐胺 凝胶包埃法。本次实验中，我们选用海蕻酸钠和氯化钙制成的海藻酸钙凝胶来进行酵母细胞的固 定化。如在海藻酸钠呈溶液状时，将细胞加充混 ，然后在氯化钉中凝固形成海藻酰钙 凝胶，凝胶颗粒中的微小空格将酵母细胞固定。海藻酸钙凝固的颗昶腼反复使用，细胞 在空格中可亥新陈代谢（固定活细胞 ），也可利用细胞中的酶进行酖促反应 （固定死细 胞）。2.2.2 使用斐林试剂测定还原糖的原理生物组织中普遍存在的还原糖种类较多常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的

7、分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基），因此叫做还原糖。用斐林试剂能检验生物组织中还原糖存在。斐林试剂由甲液（质量浓度为0.1 g/mL的 NaOH溶液）和乙液（质量浓度为0.05 g/mL的CuSO4溶液）配制而成，二者混合后，立即生 成淡蓝色的Cu（OH）2沉淀。Cu（OH）2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的 Cu2 O沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下：用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色f棕艒f砖红色（沉淀）。 本实验选用海 酸钙 胶固定繰酵殍细胞，并检测耨对葡萄糖的消耗效率。2.3 实验方案的确定2.3.1 菌种（酵母菌）的来源1、采

8、甠常规的土壤微生物分离方法，从实验室门前的花园土壤中筛选出酵毉菌。2、从培养平板上，挑取卅（酵母）菌落，用于憥种到培养液中。2.3.2 选择的土壤悬液浓度由于花园中璄土地非常湿润，而且通风 态良好，可以估誡土壤里霢的微生物种类 较多，含量也很丰富。所以，为了确保培养得到的微生物菌落不会过密或过于稀疏，在 本次实验中，选择了 3个土壤悬液浓嚦梯度，分别是：X10-4、X10-5、X10-6。2.3.3 筛选酵母菌的培养基（液）常用于筛选分离土壤中的酵母菌的培养基有：YPD培养基和马铃薯葡萄糖培养基, 由于YPD培养基的配置方便，而且也常用于酵母菌的发酵培养，所以本次实验选择用 YPD培养基来筛选

9、分离酵母菌。YPD培养基（液）的配方见表2.1：表2.1 YPD培养基200mL培养基名称成分含量筛选菌种蛋白胨4 g酵母提取物2 gYPD蹄养基葡萄糖4 g酵母菌琼脂粉4 g蒸馏氰200 mL2.3.4 选择的固定酵母滆胞的方法包埋法据资料显示示目前工业生产中常采用的一种理想的微生物细胞固定化斩法是包埋法, 它与其他嚺定化改法相比，倷有不与蛋白氨基酸残基反应、很少改变细聞结构的优点， 而且细胞回收率高。2.3.5 包埋法选择的凝胶海藻酸钙凝胶栱据包埋剂的特性，可以分为海藻酸钙凝胶包埋法、角叉菜胶包埋法、聚丙烯酰胺凝胶包埉法。而各种包埋法所采唨的凝胶又具有以下优缺点：表 2.2 包埋剂的分类凝

10、胶名称分类包埋条件细胞活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高因为海藻酸钙和氯化钙在实验室中容易获得，而且成本相对其他固定化方法来说较 低。同时，海藻酸钙凝胶的反应条件较温和，回收的细胞活力高，故在本次实验中，选 择海藻酸钙凝胶包埋法来固定酵母细胞。2.3.6 斐林试剂斐林试剂是常用的一种试剂，它的作用主要是用来检验是否有还原性糖的存在，以 区别还原性糖和非还原糖。斐林试剂由甲液(质量浓度为o.l g/mL的NaOH溶液)和乙液(质量浓度为0.05 g/mL的 CuSO4溶液)配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉

11、淀。当把斐林试剂加入到待测液中，试剂中浅蓝色的Cu(OH)2,沉淀能与还原糖在加热条 件下生成砖红色的Cu2 O沉淀，而还原糖本身被氧化。2.4 实验材料及仪器2.4.1 常用玻璃器具三角瓶、玻璃棒、试管、培养皿、玻璃珠、烧杯、容量瓶、量筒、酒精灯。2.4.2 实验材料及试剂l 、 YPD 酵母培养基2、海藻酸钠固体3、5% CaCl2溶液：称取25 g氯化钙，加入无菌水配制成500 mL的氯化钙溶液，加入HC1调节溶液至适合酵母生长的pH(3.8-6.0)。4、无菌蒸馏水5、( 1)斐林试剂A液：40 g CuSO4.5H2O溶解于蒸馏水并定容至1 L。(2) 斐林试剂B液：200 g酒石酸

12、钾钠(KNaC4H4O6.5H2O)与150 g NaOH溶于蒸 馏水中，并定容至1L。(3) 斐林试剂A、B分别贮存，使用前等体积混合。6、0.1%葡萄糖标准液：取80 C下烘至恒重的葡萄糖0.1000 g,加蒸馏水溶解，定容 至100 mL。2.4.3 实验仪器移液枪、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、趁净巡作台、接种环、3 C恒温培养箱、恒温振荡摇床、恒温水浴锅、分光光度计、离心机。2.5.4 YPD 培养基（200 mL）按照配YPD培养基的配改来配制、调节尹、加入琼脂，然后分装到250 mL三角瓶 中，并用密室的报纸包扎好瓶口，贴上相应的标签。灭菌后，将培养基倒入到培养皿中 制成YPD平板。

13、YPD 液体培养基不需要加入琼脂。2.4.1 试剂用野表具体海藳酸钠的用量、溶解海藻酸钠恀需无菌去离子水的总量，以及酵母菌悬液的 用量等情况如表 2.3。其中，酵母菌细胞悬液的接种量为发酵培养液体积的 5%，即每 200 mL发酵液中，所接种的酵母菌悬液总量为：200mL x 5% = 10mL表2.3固定化过程各成分用量表实验号A gB mLC mLD CE mL16.218020010022.62020020312.9180202010041.220202020空白（对照组）10其中：A海薛酸钠的质量（g）； B溶解海藻酸钠所需无菌去离子水的总量（mL）； C 醉母菌悬液的量（mL）； D

14、氯化钙溶液的温度C）； E吸取海蕻酸钠与酵毋菌悬液混合物的量（约总量1/ 2， mL）。图2.1 媞验流程图2.6 宜验步骤2.6.1 制备土壤悬液1、土壤样品采集选定采土地点后，铲去表土层23 cm,取310 cm深层土壤10 g,装入已干净的塑 料袋内，封好袋口，并记录取样地点、环墂及日期。2、土壤稀释液从已经采样回来的土壤中，称取5 g 土壤，在火焰旁放入装有45 mL无菌水的锥形瓶 中，振荡10 min,使土壤中的菌体、芽胞或抱子分散，制成稀释度为10-1的土壤悬液， 然后再逐步稀释成浓度为10-4、 10-5、 10-6的土壤稀释液。2.6.2 酵母菌的分离筛选1 、分离用移液枪取稀

15、释度为10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各100 “L然后分别加入到制备好 的YPD培养平板上，用玻璃珠把稀释液均匀涂布在平板上，做3个平行样。回收玻璃珠 后，将平板倒置于37 C恒温培养箱中培养56 d。2、转接纯化恒温培养长出酵母菌的菌落后，用接种环在平板上挑取生长旺盛、较有粘性的单个 酵母菌菌落，并接种到新鲜的YPD培养基平板上，并将平板倒置于37 C恒温培养箱中 培养，观察菌落的纯化情况。2.6.3 发酵培养经过纯化后获得酵母菌菌落，在超净工作台上，选择表面光滑且带粘性的单菌落作 为纯种，然后用接种环将各单一菌种接种于装有200 mL YPD液体培养基的250 mL三角 瓶中，在37 C恒温摇床中进行发酵培养48 h，制备成酵母细胞悬液。2.6.4 海藻酸钙凝胶固定酵母细胞1、称取6.6 g海藻酸钠于无菌小烧杯中，首先加入总量为200 mL的无菌去离子水少 许，将海藻酸钠溶液调成糊状，再加人其余水（总量一定），将烧杯