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1、生化实验报告正式报告食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）姓名：白壹良学号：080800201组别：第17组同组人姓名： 周亚凯钟晋指导老师： 张雯实验日期：2010年4月27日缴交报告日期：2010年5月4日食品中蛋白质含量测定【摘要】氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，测出生物样品中的含氮量即可 求出蛋白质的含量。本实验主要是通过凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的含氮量， 并掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量 计算。实验时，样品在凯氏烧瓶中经硫酸消化后，蛋白质分解，其中的氮与硫 酸作用生成硫酸铵，再在强碱条件下蒸馏出氨，用硼酸吸收，以标准酸滴定， 根据标准酸消耗
2、的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量。本实验测 出的蛋白质的含量为2.74g/100ml。【实验目的】1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理；2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算。3、学会使用凯氏定氮仪【理论背景】1、氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，而且绝大多数蛋白质的 氮元素含量相当接近，一般恒定在15%17%，平均值在16%左右，因此在 蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25g蛋白质。所以只要测 出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含 量。2、利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其
3、中C、H 形成CO2、H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液 中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。 用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮 量，再折算为粗蛋白含量。消化：2 NH2-(CH2)2 -COOH + 13H2SO4 - (NH4) 2 SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O蒸馏：(NH4) 2 SO4 + 2NaOH - 2NH3+Na2SO4+ 2H2O吸收：2NH3 + 4H3BO3 -(NH4) 2 B4O7 + 5H2O滴定：(NH4) 2 B4O7 + 2HC1 + 5H2O - 2NH4
4、C1 + 4H3BO3反应量关系：n(N)=n(Pr)=n(HC1)【实验装置1、试剂 硫酸铜(CuSO - 5H O)硫酸钾硫酸(密度为1.8419g/L)硼酸浓液(20g/L)氢氧化钠溶液(400g/L) 0.01MOL盐酸标准滴定浓液混合指示剂：0.1%甲基红乙醇浓液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇浓液5份临时 混合.牛奶样品2、仪器微量定氮蒸馏装置：如下图所示1、电炉；2、水蒸气发生器3、螺旋夹a;4、小漏斗及棒状玻璃塞；5、反应室；6、反应室外层；7、螺旋夹b；8、冷凝管;9、蒸馏液接收瓶。【实验步骤】样品消化-蒸馆吸收一滴定实验步骤实验现象样品消化1.吸取牛奶样品1ml,移入干燥的10
5、0ml凯氏 烧瓶中，加入1.2 g硫酸铜和硫酸钾混合物， 加入5ml浓硫酸，2在通风橱中加热消化，开始时用低温加热， 待内容物全部碳化，泡沫停止后，再升高温 度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明样品由白色变成黑色此反应不断进行，待有机物 被消化完后，不再有硫酸亚 铜（褐色）生成，溶液呈现 清澈的蓝绿色。消化完全指示：蓝绿色3试剂空白实验：取硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸， 按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100 ml,得试剂空白消化液。溶液为蓝色检 查 与 洗 涤 装 置检查微量定氮装置是否装好。在蒸气瓶瓶内装 水约三分之二，加入数粒玻璃珠，以防止暴沸。 测定前洗涤2至3次:从样品进水口加水
6、适量， 再从通气口加水，反复洗涤。瓶中通过压力差的作用， 能够比较方便的清洗装 置，而且洗涤效果较好碱化蒸 ，、馏1、准确吸取10.0ml样品消化液，由小漏斗流 入反应室，使10ml氢氧化钠溶液倒入小玻杯， 提取玻塞使其缓缓流入反应室，开始蒸馏2、取硼酸试剂40ml于烧瓶中，加入混合指示 剂23滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，3、当接收瓶内有8090ml时，取下接受瓶， 准备滴定硼酸加指示剂为酒红色溶液酒红色蓝绿色同时吸取10.0ml试剂空白消化液按上法蒸馏操作溶液呈天蓝色滴定以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至溶液呈灰红色为终点，记录数据溶液由蓝色变成灰红色【结果计算】项目空白实验(m
7、l)牛奶消化液(ml)样品消化液10.0010.00滴定消耗盐酸标准液1.0881.105蛋白质=叫一勺8如。逆颈。J1CI100.蛋白质= ( 1.096-0 ) *0.0284*0.01401*6.28*100/10/100=2.74%式中：蛋白质一蛋白质的质量分数，%；c 一盐酸标准溶液的浓度，mol/L;V1试剂滴定消耗标准液量平均值，ml;V2空白滴定消耗标准液量，ml;m样品质量，g;0.01401 氮的毫摩尔质量，g/mmol;F一蛋白质系数。一般食物为6.25;乳制品为6.38;面粉为5.70;高粱为6.24;花生为5.46;米为5.95;大豆及其制品为5.71;肉与肉制品为6
8、.25;大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83;芝麻、向日葵5.30。【注意事项】1、凯氏定氮法测蛋白质含量是依据氮元素与蛋白质的对应关系，从而通过 测定氮元素的含量而测定蛋白质的含量，故使用此法须注意以下几点：A、应首先确定样品中无其他含氮化合物，以免使计算结果偏大；B、尽量确保消化和吸收的充分，以免氮的流失，致使结果偏小；C、吸收式防倒吸，以免导致实验失败和机器损坏。2、消化时注意问题： 加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈； 消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便 利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全; 样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体
9、石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫； 消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水 配制。3、蒸馏、吸收注意问题：(1)整套装置不能漏气，要注意各蒸汽控制夹子的操作，以防蒸汽受阻爆 炸或吸收液倒吸。(2 )在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。(3) 加碱量要足，应使消化液呈深蓝色或产生黑色沉淀。操作要迅速，漏 斗要采用水封防氨逸出。(4 )冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏；吸收液温度不应超 过40C，若超过时可置于冷水浴中使用；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离 液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开， 最后
10、关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。(5) 在每次测定前及两次测定之间，均要洗涤反应管(倒吸法，在吸收瓶 中加入蒸馏水，其余同测定时的做法，在蒸汽发生器中水剧烈沸腾后，立即移开 电炉，水即从吸收瓶中倒吸入反应管，再倒吸入汽水分离管或蒸汽发生器中，打 开夹子，即可放出废水。(6) 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液 中呈红色4、本法适用于固体、半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范 围为 2.00g5.00g;液体样品取样 10.0mL25.0mL(约相当氮 30mg40mg )。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。【讨论】(1)、算法:凯
11、氏定氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，而且绝大多数蛋白质 的氮元素含量相当接近，一般恒定在15%17%，平均值在16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25g蛋白质。所以只要 测出生物样品中的含氮量，在乘以6.28，就可以计算出样品中的蛋白质 含量。反应量关系：n(N)=n(Pr)=n(HCl)、误差分析： 样品中可能含有其他含氮物质使结果偏大 提取样品溶液时，由于操作不规范，出现溶液提取值偏差 牛奶的消化不完全，蛋白质分解不充分，氨没有很好的和浓硫酸结合，造成氮的流失，导致实验值偏小； 在定容过程中，有部分消化液残留在玻棒和凯氏定氮瓶中 试剂用量没把握好，导致反应
12、进行得不彻底 滴定时，操作不规范，读数读得不够准确；对颜色的误差也不可避免，导致滴定终点的判定也会有一定的误差(3) 、粗蛋白：用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核 酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物， 所以这样的测定结果称为粗蛋白。(4) 思考题1. 预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作。答：(1)氮元素是蛋白质区别于糖类，脂肪等的特征，而且绝大多数蛋白质的 氮元素含量相当接近，一般恒定在15%17%，平均值在16%左右，因此在蛋白质 的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.28g蛋白质。所以只要测出生物样品中 的含氮量，再乘以6.28，就可以计算出样
13、品中的蛋白质含量。(2)利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H 形成CO2、H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然 后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸 溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋 白含量。消化：2 NH2-(CH2)2 -COOH + 13H2SO4 - (NH4) 2 SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O蒸馏：(NH4) 2 SO4 + 2NaOH -2NH3 +Na2SO4 + 2H2O吸收：2NH3 + 4H3BO3 -(NH4) 2 B4O7 +
14、 5H2O滴定：(NH4) 2 B4O7 + 2HCl + 5H2O - 2NH4Cl + 4H3BO3反应量关系：n(N)=n(Pr)=n(HCl)2. 蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？答：碱蒸馏使氨游离，再用HCl标准溶液就可测出含氨量，最后得到蛋白质的量， 加入氢氧化钠可以加速反应。3. 实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？答：硼酸温度、试剂的用量、PH、溶液浓度、人为误差。(5) 、预习时存在的问题：加入硫酸铜，硫酸钾，浓硫酸的作用分别是什么？答：浓硫酸的作用：脱水作用一使有机物脱水并碳化为C、H、N氧化作用一将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被
15、还原成二氧化硫2H2SO4 +C =2SO2+ 2H2O + CO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成 硫酸铵留在酸性溶液中消化时要加入硫酸钾、硫酸铜加入硫酸钾的作用是：提高消化温度加入硫酸铜的作用是：催化作用、指示作用(消化完全指示：蓝绿色；蒸馏 时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀)(6 )实验心得体会本次试验较为复杂，操作步骤较多，历时较长，很多步骤都会忘了，因此预 习一定要做好，只有在熟练预习内容，知道每一步的原理，目的，要求的情况下 才能把实验做好，当然不懂得一定要请教老师，切忌不懂装懂绝对不能忽视空白试验，空白实验并不是可有可无，对于实验数据的处理至 关重要！滴定终点的判断并不是如书上所说的，很多事情并不能依葫芦画瓢，必须根 据具体情况具体分析。有些药品
