设计引物原则以及如何查找基因序列

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1、引物设计原则:1. 找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2. 采用primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点： 1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致 其延伸温度大于74C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应2。 2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率 增加2。 3.引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错 配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高

2、于其他3个碱基，因此 应当避免在引物的3端使用碱基A34。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物2。 4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大25。 5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72C左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有 多种方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 67O 6. AG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基

3、对的相对稳 定性。应当选用3端AG值较低(绝对值不超过9)，而5端和中间AG值相对较高的 引物。引物的3端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 6。 7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带， 并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行8。 8.对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的 载体的相应序列而确定。如果文献上的这个基因跟你是同一物种来源的话是可以运 用别人的引物看看他的引物是基因组的还是cDNA的。cDNA的可以直接用。基因组的就再看看了好的引 物对实验进程不会延缓我觉得在涉及

4、引物只要遵循以下的原则，一般是没什么问题!我是从来不借助什么专业软件 来设计，按照自己的需要选取就是了，一般20bp，不浪费!到目前还没有失败过！ 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增 高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应 以减少由于密码 子摆

5、动产生的不配对。(5) 在引物内，尤其在3端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存 在4个连续碱基的同源性或互补性。(7) 引物5端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、 起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等通常应在5端限制 酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生 非特异性扩增，影响产量。（9）简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简 并性。否则可能由于产量低

6、而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为O.2-1.0“mol/L引物过多会产生错误引导或产生引物二聚 体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯 中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L= OD260/ A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。如何查找基因序列NC表示人类基因组DNA的RefSeq。（链接序列）NM 表示 mRNA 的 RefSeq。NP表示蛋白质的RefSeq1.根据文献中已知的基因ID如果你在文献中看到你感兴趣的基因，而且文中还提

7、到了该基因在Genbank中的ID 号，那就好办了，直接打开http:/www.ncbi.nlm.nih.gov，在Search后的下拉 框中选择Nucleotide，把Genbank ID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可 以找到了。（如 GenBank accession number gi 16151096）”。2. 根据已经获得的基因的相关信息进行查找打开http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/在 search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文 本框中输入基因名称“VEGF”，点击GO。搜索结果出来了，点击箭头所指的Limits, Limits 的意思其实

8、就是高级检索，你可以在这里对检索词进行很多限制，这样能大大精简查询结果。 我们接着来，在Limits这个界面，先选择查询的限定范围：先选Gene name（基因名称）； 然后再选择Limit by Taxonomy （生物分类限定）中的Homo sapiens （人类），然后再点击 “GO”。直接点击基因名称“VEGFA”就可以看到有关基因的信息了。需要指出的是，在 Genbank中，基因有很多别名（Aliases），和Genbank中记录的名称有可能不一致。比如 在这里，VEGFA是Genbank中记录的基因名称，而它还有很多别名，比如MGC70609, VEGF（这就是我们要找的基因名称）

9、，VEGF-A, VPF；还有，在这里可以看到该基因在染色体上 的位置.再往下看，可以看到 Genomic regions, transcripts, and products 这里显示了该基因在基因组中的位置，以及转录本的生成情况：就看见了目的基因的mRNA的链 接（如NM_001025366.1）和蛋白质的链接（如NP_001020537.2）这里得说两句，有的基因也许只有一个编码序列，但有的基因有很多的mRNA剪接体，但都是归在一个基因名称 下面。比如，在VEGF基因下面有7个序列，分别是vascular endothelial growth factor A isoform a, is

10、oform c, isoform d, isoform e, isoform f , isoform g, isoform b precursor，但是哪个是自己想找的基因呢？这就需要根据你自己查阅的文献以及在这些基 因序列后面的解释来确定了。如果我想找的基因是第一个序列即isoform a,就可以点击 NM_001025366.1，ncbi中查找基因序列的方法和三个号码ncbi首页，点击左侧Genes&Expression进入后，点击中间页面DATABASES里的GenBank， 进入 GenBank 页面。选 CoreNuleotide。搜Saccharomyces cerevisiae

11、tpsl”一例子：查找酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）里的海藻糖合成酶基因（tps1）Nj-liond IJ.bi.aiy of MedicineNalioiial LisLilutg of ffcalUiPubMed All DatabasesBLASTOMIMBooksTaxBrowserStructureSearch CoreNucleotidev for Saccharomyces cerevisiae tpsSITE MAP丫船,皿 取 I HotSpots即可出现很多条目，找到Saccharomyces cerevisiae的就是NC_001134 了，

12、点击后就进入该 基因所在染色体的界面了，再在“编辑”中“查找” tpsl就可以看该基因所在的位置，再 点击CDS或者GeneID:852423都可以出现相关链接！当然，如果你在文献查到目的蛋白的序列号如NP 009684.1或者GeneID:852423，那分 别在Search后选择Protein或者Gene也可以出现相关链接！二.基因CDS区界面的3个号码http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=50593115&from=488899&to=490386& view=gbwithparts找到后，我发现该界面有3个标记，一个是NC_

13、001134，其次是gi:50593115，最后是 FEATURES中的gene中的/db_xref= GeneID:852423”，他们分别是什么号码，用在什么地 方呢？尝试中，终于发现，在 Search “Nucleotide”或者“Core Nucleotide”时，for 后面是 NC_001134，最终go 到 该基因所在染色体全长序列的信息，所以NC_001134应该是该染色体的登录号吧？在 Search “Nucleotide”或者“Core Nucleotide”时，for 后面是 50593115，最终 go 到 该基因所在染色体全长序列的信息，所以50593115应该是该染

14、色体的号吧？在Search “Gene”时，for后面是852423，最终go到该基因的信息，所以852423应该 是该基因的登录号吧？所以我们如果要记住目的基因在ncbi中的位置就记住这个GenelD! 其他像NP_009684是基因编码的蛋白质的登录号。文献中查到的基因往往给的是Gene ID 三.引物设计第一步-找编码序列的方法在Search “Gene”时，for后面是852423，最终go到目的基因的信息AJIFubkl&dProkinEtnjdinFkIDTjjSearch Gguid| Bn 11 cieai| Sg 5削i?hLimitm Pr己妃心帔HisEiy / Clip

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