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1、双缩脲法双缩脉法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脉试剂是一个碱性的含铜试液， 呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多 肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可 见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。双缩脲反应双缩脉反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与 蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。双缩月尿试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱 性环境，因此它可被其他碱，如 氢氧化钠所代替。向试剂中加入 碘化钾 可延长试剂的使用寿命。（一）实验原理双
2、缩尿（NH3CONHCONH3 ）是两个分子尿经180C左右加热，放出一个分 子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩尿与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个 中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨 基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰 物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩尿法常用于需要快速，但并不 需要十分精确的蛋白质
3、测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结品牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋 白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋 白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0. 05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和 6.0克酒石 酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用 500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升 10% NaOH溶液，用水稀释到1升，
4、贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶 中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2, 0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025C）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组 测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的 蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。1.按下图表所示加入相应的试剂或样品管号 试剂0123456牛血清标准蛋白溶液（ml）2mg/ml-0.61.21.82.43.00待测蛋白液（ml）-3.0蒸馏水（ml）32.41.81.20.600蛋白质浓度（mg/ml）00.40.81.21.62.0未知2. 各管混匀后加入双缩服试剂3.0ml，充分混匀；3. 37 度水浴 30min；4. 在540nm处以0号管调零点测定各管吸光度；5. 绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标;6. 对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。肽提取率（%）=滤液中肽量/总蛋白量X 100%
