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1、实验三 固定化酶制备及酶活力测定【实验目的】1. 掌握包埋法固定化酶的操作技术。2. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。3. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一 定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是 测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增 加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由 于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确 测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。碱性蛋白酶在碱性条件下，可以
2、催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨 酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物） 发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定， 容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不 同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶 在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不 溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中, 它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可 反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点， 且比水
3、溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固 定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影 响。酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。屉的旳宦建方法:U仰佶合涪恵子詰含祕物理吸附法橇寺型徴験横型载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上（图 1）。一般来讲,载体 的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用 的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。裁怖悔图L毅体结合注固定 化酶模式 共价结合法 是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的 连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨
4、酸的巯基、组 氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤 维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子（聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯- 顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固 定化酶,酶和载体的连接键结合牢固,使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活 力较高的固定化酶。 离子结合法 通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法 能引起离子结合的载体,除具有离子交换基团的多糖类外,象离子交换树脂（见离子交
5、换剂） 那样的合成高分子衍生物也可用作载体。离子结合法与共价结合法比较,操作简便,处理条件 温和，可以得到较多高活性的固定化酶。但载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和 pH 的影响。 物理吸附法 将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。常使用的载体有活性 炭、氧化铝、高岭土、硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等。物理吸附法操作简便、费用较省, 可供选择的载体类型多,有的可以再生。但酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶容易从载 体上脱落，酶的非专一性吸附会引起酶的部分或全部失去。交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法（图 2）。 常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异
6、氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与 此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的a-氨基、赖氨酸的&氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化（图 3）。所用的凝胶有琼 脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶 包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、 粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为 在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机 械强度降低。【实验材料】1. 试剂（1）海藻酸钠、
7、 3.0氯化钙；（2）碱性蛋白酶：精确称取干酶粉1克，加入10 mL pH 10 缓冲溶液，在小烧杯中溶解， 并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液 如此反复搅拌溶解 4 次，最后全部移入 100mL 容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇 匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液10 mL,移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释 至刻度，所得液为稀释1000 倍的酶液(1.0 mg /mL)。(3) 福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO42H2O)、125g钼酸 钠(Na2MoO42H2O)、350mL蒸馏水、25 mL 85%
8、磷酸及50mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。 回流完毕，再加25g硫酸锂、25 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱 除过量的溴，冷却后定容到500 mL。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水 稀释。(4) 1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2 mol/L NaOH 4mL，充分研磨，用蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后 冷却，定容至100mL，保存于冰箱内。(5) pH 10缓冲溶液：甲液(0.05 mol/L硼砂溶液):取硼砂(Na2B4O710H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL
9、。 乙液：0.2 mol/L氢氧化钠溶液。配制pH 10硼砂氢氧化钠溶液:吸取甲液50 mL，再加入乙液21mL，用蒸馏水定容至200 mL。(6) 标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1mL 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容 至50 mL,即得1 mg/mL酪氨酸标准溶液。(7) 0.4 mol/L碳酸钠溶液，0.4 mol/L三氯醋酸溶液。2. 仪器磁力搅拌器、恒温水浴锅、注射器、烧杯(100 mL，500 mL)、布式漏斗、分析天平、容量 瓶、移液管、 721 分光光度计；【实验操作】1. 酶的固定化称取1.00 g海藻酸钠于盛有30 mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，
10、放置室温渐冷 却至38C左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20 mL。用注射器抽取海藻酸钠酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200 mL 3.0%氯化钙溶液的烧杯 中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30 min，倾去氯化钙溶液，用适 量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。2. 酶活力测定 制备酪氨酸标准曲线(1) 取 7 支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。(见下表) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40C水浴中保温15 min，取出后， 加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL,充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。分
11、别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL， 充分摇匀，于40C水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量(微克数)为横坐标，绘制标准曲线。试管編号（魂）1 tPg/mL酩贏酸 标谁溶液（mL）蒸詹水（mL）0001011000.11.922000.2l.g33000.31.744000.41.655000.51.566000.61.4固定化酶活力测定上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 m
12、L pH 10缓冲液的三角瓶 中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40C水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL三 氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液+ 1 mL蛋白酶液+3 mL三氯醋酸溶液+ 1 mL 1%酪蛋白 溶液（顺序不可颠倒），于40C水浴保温15min。摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL， 充分摇匀，于40C水浴保温15min，然后每管各加入3 mL蒸馏水，摇匀。用721型分光光 度计在波长680 nm处，以对照管为对照，测定吸光值。【结果与计算】2. 本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在p
13、H 10, 40C的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为 一个酶活力单位（U）。3. 本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算：每克碱性蛋白酶的活力单位=m / t xfm：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（|ig）；第4 / 5页t： 酶促反应的时间（15 min）；f：酶的稀释倍数，本实验中f = 1000;【注意事项】1. 酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40C以下后再加入酶 液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。2. 固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠一酶混合物向CaCI2溶液滴加的速度不要过快，混合物 要呈颗粒进入CaCI2溶液，以免形成念珠状颗粒。
