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1、胰岛素制备Prepared on 22 November 2020生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激 而分泌的一种蛋白质激素。二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素 中有 1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸， 即为半合成人胰岛素。3、重组人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素)：利用生物工程技术，获得的高纯度 的生物合成人胰岛素，其氨基
2、酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombinant human insulin, rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli， E . CO )分别发酵生产人胰岛素(human insulin, hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得 到hl。这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E . coli发酵生产人胰岛素原(hu一man peoinsulin, hPI),后经加工形成 hl。E . coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常
3、采用 融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能 形成有活性的hi ；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌 表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(150mg/L)，产量 低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高 效的表达策略I2 J尤其是对E . CO尻表达系统的研究更是越来越深入，用E . coli系统 表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂， 复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提
4、高重组目的蛋白表达 量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了套经过优化的高效完整的基因工程E . coli发酵表达(His)6Arg一Arg一人胰岛素原(His)6Arg一Arg一human proinsulin， PPh PI，后加工成hI的制备工艺。四、基因工程制备胰岛素1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基 因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：(1) 鸟枪法：用大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。 至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针(2) 人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有 内含
5、子。(3) 从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用(4) PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒 为环状。主要有如下2种方法：(1)碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于 酶切、PCR扩增、银染序列分析。( 2)煮沸法3、基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。4、将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaC12，这使 细胞会吸收外源
6、基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸 收。将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组 质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取 和容纳外来DNA的生理状态）。5、胰岛素的产生：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白 质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。（注意：大肠杆菌产出的是多肽 链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进 行菌体外加工。）五、关于胰岛素制备的一些问题人体是这么产生胰岛素的第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向m
7、RNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆 的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用 除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链 胰岛素原（Proinsulin）。胰岛素原随细胞 浆中的微泡进入高尔基体，连接上二硫键，经蛋白水解酶的作用，切去31、 32、 60三个精 氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，形成a链和B链的胰岛素，分泌到B细胞外，进 入血液循环中。大肠杆菌没有高尔基体等细胞器，基因工程如何利用大肠杆菌合成胰岛素 微生物学教程（周德庆）：1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使合成 了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分
8、别组合到的不同质粒 上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、 B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫 键使这 2条链连接成有活性的人胰岛素。所以大肠杆菌产生的胰岛素，需要用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接 成有活性的人胰岛素。大肠杆菌是原核生物，细胞器只有线粒体，但它有相关的酶在细胞质内。和蓝藻进行 光合作用一样，蓝藻也没有叶绿体，但它可以合成相关的酶。因此，只需要细胞质就可以 了！1、合成胰岛素需要高尔基体和线粒体是对人或真核生物而言2、原核生物的生长和发育也需要蛋白质，从哪里来的呢当然是自身合成， 这说
9、明原核生物合成蛋白质只需要线粒体和一些酶，当然还有能量人体产生胰岛素首先是一个基因转录成一个mRNA，再翻译为一条肽链，这条肽链再加 工，就形成了由二硫键连接的2条肽链。通过基因工程在产生胰岛素是先分别形成A、B链的2个基因，转录形成2个mRNA， 翻译成2条肽链，在外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。六、胰岛素的研究历史胰岛素的发现是20 世纪生物医学界最为重大的成就之一。同时胰岛素的问世也引起了 许多科学家的兴趣。他们对胰岛素的生产、生物合成、化学合成、结构、功能、作用机制 等进行了一系列的研究并获得了多个里程碑式的成果。动物胰岛素的生产起始于加拿大的ConnaughtLabor
10、atories，大量生产主要在美国的礼来 （EliLilly）公司。1923年末商品胰岛素已广泛应用于临床。我国动物胰岛素的生产起步也 不晚。解放前，上海的杨氏药厂已能生产结晶猪胰岛素。解放后，国内的生产厂家主要是 上海生化药厂和徐州生化药厂。为了使胰岛素能就地取材，就地生产，最好不用减压蒸发 去乙醇。为此，南京和上海分别试用了离子交换法和锌沉淀法。1978年美国的 2个实验室合作，通过基因工程使合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛 素基因A、B链的人工合成基因分别组合到的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组 质粒在细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰 岛素
11、A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰 岛素。随着科学技术的发展，现在科学家已经改为用酵母菌、昆虫培养细胞、或哺乳动物培养 细胞等真核细胞作为表达载体，而少用大肠杆菌。重组DNA技术的出现为利用微生物生产人胰岛素铺平了道路。1979年，美国Genentech 公司的Goedell等报道了化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中的表达。1982年，美国礼来 公司生产的重组人胰岛素Humulin上市。为改进重组人胰岛素的生产，丹麦的诺和诺德 (Novo Nordisk)公司用酿酒酵母真核细胞表达一种胰岛素单链前体，在前体中B1至B29 通过甘-甘-赖三肽和A1至A21
12、相连接。近年来，国产的重组人胰岛素相继问世。通化东 宝公司于1998年获准生产人胰岛素注射液，商品名甘舒霖。深圳科兴公司的苏泌啉和徐州 万邦公司的万邦林也于2002年和2003年获得生产批文。虽然重组人胰岛素已在临床上广泛应用，但是由于胰岛素分子容易聚合，在浓度较高 的胰岛素注射液中主要以二体和六体的形式存在。为了解决这个问题，通过蛋白质工程开 发出的单体速效胰岛素也应运而生。首先，美国的礼来公司开发了单体胰岛素Humalog， 其中B28位的脯氨酸和B29位的赖氨酸互换。随后，丹麦的诺和诺德公司也开发了单体胰 岛素Novorapid，其中B28位的脯氨酸突变成天冬氨酸。1972年，前苏联的生
13、物化学杂志上 报道了胰岛素用胃蛋白酶水解去除B26至B30的肽段后可以得到保留胰岛素活性的去五肽胰 岛素。由于胰岛素对治疗糖尿病的重要作用，关于胰岛素的品种、剂型、生产方法等的报道日 新月异、层出不穷。七、胰岛素的展望胰岛素是由胰产生的一种蛋白。它在人体新陈代谢中起着重要作用，如果体内不足就 会引发糖尿病，因此胰岛素是治疗糖尿病的特效药。这种病发病率很高，困扰着上千万 人。过去从猪、牛胰中提取胰岛素，产量低，满足不了患者的需求。现在利用基因工程技 术，有两种方法可以让微生物发酵产生胰岛素。一种是先在大肠杆菌中分别合成胰岛素A 链和B链，然后再在体外用化学方法将两条链连接成胰岛素。美国Eli lilly公司采用这种 方法生产胰岛素。另一种是采用分泌型载体表达胰岛素原，然后再将其转化为胰岛素。丹 麦Novo Nordisk公司就是采用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。
