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1、实验前准备实验器材：干棉球、酒精棉球、75%酒精、生理盐水、注射器(1ml、2ml)、黑 色记号笔、固定大鼠用粗线绳、大鼠板、 染色小烧杯、标本瓶 手术器械：备皮剪子 1、眼科剪 1、大直镊 1 只、小弯镊 1 对、(动脉夹 2)、 止血钳 2-3、缝合线、缝合针、持针器 麻醉剂： 10%水合氯醛( 400mg/kg)保温：60W白炽灯，于37cm高处直接照射能使肛温保持在 37C栓线：直径0.24mm,头端光滑圆钝；在栓线18mm的位置用黑色记号笔标记； 75%酒精清洁后置 1: 2500 单位肝素化生理盐水中备用。体重与栓线直径：直径0.24mm的栓线适用于体重220-280g的SD大鼠。
2、TTC的配制：用0.2mol/L磷酸缓冲液(PBS)配成2%TTC溶液(pH7.4),避 光保存。药物配制：无论生理盐水还是受试药物标签均采用代号， 给药及评分均采用单盲。仪器激光多普勒血流仪(Laser Doppler Flowmetry, LDF)系统，包括：PeriFlux 5001 Ma in Unit，PF5010 LDPM Unit (激光多普勒微血流灌注量检测单元)，LD Probe407-1 ( Perimed Co., Jarfalla, Sweden ;大鼠脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命 科技有限公司)；牙科手钻(Stron g 90#, Korea);大鼠脑切片模具；荧光
3、正置 显微镜(NIKON ECLIPSE 80i, X400)及成像系统( ACT-2U NIKON Imaging System)。大脑中动脉栓塞( MCAO )模型的制备参照Zea Lon ga等2建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，作适当改进。10 %水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射麻醉动物。大鼠仰卧位固定，颈部正 中切开皮肤，钝性分离各层组织，暴露右侧颈总动脉 (CCA) 。分离至颈内动脉(internal carotid artery， ICA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)分叉 后一段，仔细分离避免损伤迷走神经和气管，置线备用。于颈内、
4、颈总动脉处用动脉夹夹闭， 颈外动脉近心端及远心端结扎， 中间剪 断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将尼龙线由颈外动脉插入， 插入后用 0号丝线结扎，以防止出血，打开颈内动脉处动脉夹，将尼龙线插入颈 内动脉，继续插入至颅内，插入深度约18.5 .5mm至微感阻力，使尼龙线头端通 过MCA起始处，到达较细的大脑前动脉，此时即实现右侧大脑中动脉的血流阻 塞，结扎ICA以固定尼龙线和防止出血，逐层缝合，尼龙线残端留I cm长于皮外。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术， 不结扎及导入线栓。 手术过程中室 温保持在24-25C，生物机能实验系统进行动物呼吸及心电监测。3局部脑血流量测定大鼠俯卧
5、位固定于立体定位仪上， 开颅窗并清理手术视野， 以前囟为坐标原 点，选取前囟后1-2mm、右侧2-4mm为测定点9，周围直径约2-3mm区域用牙科 钻打薄，保持硬脑膜的完整并避开较大的血管，定位并固定好探头座。将动物从定位仪取下并使其仰卧位于手术台上，进行 MCAO 手术，当线插 入 ICA 后先不插入颅内，稳定 LDF 读数后，记录 5min 内血流值，以其平均值 作为脑血流的基础值（baseline value。把线插入颅内，当血流值突然下降至基 础值的 10%-20 % 时，提示中脑动脉血流已被阻断。每组 MCAO 前的血流值为 本组的基础值（ 100），手术后血流值均以此基础值的百分率
6、表示。4神经行为学检查Bederson 评分动物于给药前及处死前进行神经行为学观察，参照 Zea Longa的方法，提鼠 尾离开地面约 1 尺，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察 两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察其行走情况。采用四级评分法（ 0-5 分），分数越高，说明其神经行为损伤越严重。（1）行为完全正常者，记 0分；（2）提起鼠尾离开地面，手术对侧前肢内旋、内收者，记 1分；（3） 大鼠至地面，用手挤压两侧检查其抗力，手术对侧抗力下降者，记2分； （ 4）大鼠至地面，观察其行走，围绕手术对侧转圈者，记 3分；（ 5）损伤极其严重，已无法自主活动者，记 4分。5脑梗
7、死体积的测定：评分后大鼠断头处死，迅速将取出的脑组织置于 -20 C冰箱，10mi n后置室 温环境，将脑置于大鼠脑切片模具中， 切除嗅球、 小脑和低位脑干后按图谱所示 间隔2mm冠状切五刀，切成6个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置于 5ml 含2%TTC的溶液中，37C恒温、避光孵育30min,期间每隔5min将脑片翻动一次。 经 TTC 染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。将每组脑片 排列整齐， 拍照保存， 应用图像分析系统软件处理并作统计， 计算每张脑片的梗 塞面积，乘以每片脑片的厚度2mm,每只动物所有脑片梗塞面积乘以厚度相加， 即为脑梗塞体积。 梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示， 以消除脑水肿的影 响。
