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1、血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估国外医学输血及血液学分册2005年第28卷第6期血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估刘芳综述王兆钺审校【摘要】血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13,vWFCP)裂解血浆中具有高黏附能力的超大分子量血管性血友病因子(ULvWF),防止血小板因其引起聚集形成血栓.ADAMTS13活性异常是临床上血栓性血小板减少性紫癜(TTP),特别是遗传性TTP和特发性TTP发病的基础.其活性的检测在TTP临床诊断和治疗上具有日益重要的意义.目前报道的一些用于检测ADAMTS13活性的方法有十余种,本文对此进行综述.【关键词】血管性血友病因子裂解蛋白酶;
2、血栓性血小板减少性紫癜;yonWillebrand因子;检测ADAMTS13(adisintergrinlikeandmetalloproteasethrombospondintype1motifrepeats),也被称为vWFCP,是1996年首次报道的血浆中vWF裂解蛋白酶口.研究表明,血浆中ADAMTS13在一定剪切力的条件下,作用于vWF分子A2区842酪氨酸与843位蛋氨酸之间的肽键,将vWF裂解为不具有黏附活性的两个片断.目前检测ADAMTS13活性的方法正是依据这一机理设计的.无论使用哪种试验手段,最终是通过检测vWF是否被裂解来判断前者的活性.其方法主要有以下几种.1检测vWF
3、多聚物1.1定性法Furlan等使用SepharoseCL一2B凝胶滤柱从人冷沉淀中分离vWF多聚物,经酶联免疫试剂盒测定vWF含量,并将待测的含ADAMTS13酶的血浆在10mmol/L的BaC1溶液中37C温育5min,以达到最大的裂解活性,再将血浆与一定量的vWF多聚物按比例混合,放入含1mol/L尿素(使vWF变性并使其空间结构舒展,暴露酶切位点)pH8.0的TrisHC1透析液中,37C透析24h.将透析后的液体按Ruggeri和Zimmerman报道的水平十二烷基磺酸钠一琼脂糖凝胶电泳(SDSPAGE)法在80V,10mA条件下,16C环境中电泳17h.电泳后,使用放射性I标记的v
4、WF多克隆抗体进行放射白显影,或是电转膜后使之与酶标的抗人vWF多抗结合,增强化学发光法显影口.将正常人血浆按比例稀释后作标准曲线,标准曲线中ADAMTS13活性依次设为1:20(活性100),1:40(5O),1:8O(25).1:160(12.5),1:320作者单位:215006,苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所?519?综述?(6.25),1:640(3),缓冲液(0).待测血浆1:20稀释.根据其多聚物电泳情况,判断ADAMTS13活性水平.该方法的缺点是其使用的底物纯化的vWF中有一定的内源性ADAMTS13,目前用该手段检测ADAMTS13活性多使用改良法,即使用商业化的vW
5、F纯品l4,或使用重组vWF,以上两种底物均无内源性ADAMTS13.如使用从正常人混合血浆中获得的vWF则只收集早期的片段(无内源性ADAMTS13),或用丝氨酸蛋白酶抑制物,抑制其内源性ADAMTS13的活性.经典的vWF多聚物电泳操作步骤复杂,耗时较长,不宜应用于临床.其结果的可信性曾遭到Tsai的质疑l6.但在2004年发表的十一种ADAMTS13检测方法评估中,应用该方法检测的结果与预期值一致性高,决定系数(r)达0.94,是目前应用的较为稳定的方法之一.为将此方法应用于临床,2001年Aronson等口报道使用自身的vVw作底物,直接将血浆在含尿素的缓冲液中透析过夜,再电泳.该方法
6、在一定程度上缩短了检测时间.是我室检测ADAMTS13活性较常用的方法之一.1.2定量法Flowchamber法检测ADAMTS13切害0ULvWF的能力是目前惟一一种定性检查方法.该法与其他各实验室在静态的基础上完成酶裂解的过程完全不同,可真实模拟体内环境,在一定剪切力的基础上检测ADAMTS13的活性.Flowchamber小室中单层培养的人脐静脉血管内皮细胞在一定条件刺激下生ULvWF,使用正常人的血浆和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)患者的血浆按一定流速灌注,血浆的流速产生剪切力2.5dyne/cm.,10min之内,正常人血浆中ADAMTS13可以切断ULvWF,而TTP患者的血浆灌
7、注时则形成ULvWF黏附在内皮细胞表面,血小板不断黏附在ULvWF上,形成潜在血栓的状态.该试验方法在评估中结果不理想,在检测预期ADAMTS13活性在20的样本时,仅有不到一成的检测率.2vWF裂解片段的检测该类型的检测目前有四大类方法:十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳;免疫放射计量试验(IRMA);胶原结合试验(CBA);荧光共振能量转移法(FRET).前两者直接检测裂解片段,后者通过检测未裂解的vWF和胶原结合能力来判断ADAMTS13的活性水平.2.1SDSPAGE法Tsai_2与Furlan等口同时报道分离出vWFCP,但前者检测该酶活性的方法与后者截然不同.Tsai是将底物vWF
8、预先用0.15mol/L的盐酸胍处理(终浓度,作用与尿素相同),在样品一底物反应混合物中加CaCl.激活vWF裂解酶,反应条件为37C1h,结束时加入含5mmol/L的乙二胺四乙酸的十二烷基磺酸钠(SDS)(pH6.8)上样缓冲液终止反应.vWF单体分子量约为225kDa,经ADAMTS13裂解后,产生140kDa和176kDa两个片段.试验中vwF是以二聚体为单位被裂解,在还原型SDSPAGE电泳时,产物为200kDd和350kDd两个片段.Kokame等El1改良了该方法,他们使用人重组的vWF片段(aa15961668)仅有73个氨基酸的A2区片段,通过电泳检测裂解后的片段,以此判定酶活
9、性.尽管这类方法被Tsai认为是检测ADAMTS13活性最直接最可靠的方法,但在11种方法评估中却发现结果并不理想.参与评估的是Remuzzi等口使用的类似方法,底物为重组的vWFA1A2A3区.在应用该方法检测ADAMTS13活性时,结果与预期值一致度不高,r为0.77,每份分析样本的组内差异较大,变异系数(CV)值均超过20.2.2IRMA使用重组wTrvWF作底物,避免了底物中含有活性ADAMTS13.待测血浆中加10mmol/LPefabloc丝氨酸蛋白酶抑制剂.实验前,用BaC1激活ADAMTS13,激活条件与其他试验相似.将待测血浆和底物混合在含尿素的缓冲液中室温下透析18h,使用
10、IRMA检测残留vWF含量.Obert等_1使用抗vWFC末端16062183位的单克隆抗体包板,使用抗N末端7641035的I标记的单克隆抗体作二抗,夹心法定量检测未被裂解的vWF:Ag含国外医学输血及血液学分册2005年第28卷第6期量.该方法与其他方法相比,尽管操作上无复杂之处,但其各项检测指标均被评为最低7.2.3残余CBA常用的方法根据底物来源不同分为以下几种:有使用商业化的纯化的vWF;使用重组的vWF(不同作者使用的重组片段大小不同);使用血浆来源的vWF;利用患者自身血浆中内源性vWF(此方法为半定量).经典的CBA检测ADAMTS13活性是由Gerritsen等E14提出的,
11、从冷沉淀中获得的vWF经一些预处理,如使用乙二胺四乙酸(室温,3h)抑制内源性ADAMTS13的活性,试验前加尿素变性,试验血浆使用1/10体积比的BaC1.活化,在尿素反应液中37C温育3h,去除内源性vWF,之后将待测血浆与底物反应,使用Na.SO终止反应,使用CBA试剂盒检测.如果底物为重组的人A2区小片段(aa718905,两端加如6hisTag和Tag一100),则省去了上述步骤,并且不用胶原包板,而是根据Ni离子结合6his的原理,使用Ni离子包板_1.患者血浆按比例稀释,与A2区底物混合,加入96孔板,37C温育2h.使用抗Tag一100抗体,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测.
12、该方法无须尿素变性,试验时间不超过5h,是所有ADAMTS13活性检测中耗时较短的.Rick等1也对上述经典方法作了改良,去除了纯化底物,预处理等步骤.直接应用患者内源性vWF,将患者血浆稀释后直接透析37C23h,检测透析前,后胶原结合能力的差异,以此计算ADAMTS13活性.此方法耗时不超过9h.为我室常用的方法之一.有几种CBA的方法参与了评估中包括以重组或是纯化的vWF作底物的,其一致性不一,r.从0.580.97不等.Rick的方法一致性尚可,r.为0.81,并且在所有CBA中,CV值最低.但该方法对低ADAMTS13活性的标本检出率也低,容易漏检_7.2.4FRETKoichi等为
13、弥补使用SDSPAGE法检测ADAMTS13活性对技术层面要求高及耗时长而不利于临床应用的缺陷,采用FRET检测底物被裂解的情况.试验利用了作者日前发表的A2区短片段n,首先合成荧光标记的底物vWF73(FRETSvWF73),将一定浓度的底物与按比例稀释的待测血浆一同加入96孔白板,在检测仪上每5分读数一次,60分终止读数.ADAMTS13活性正常的样本荧光值随时间增加而增长,活性缺乏的患者荧光值无变化.整个试验耗时<2h,是目前最快的检测方法.只是该方法最近创建,未参加评估,其灵敏性和稳定性还有待进一步观察.3检测瑞斯托霉素辅因子2002年Bohm等根据瑞斯托霉素辅因子含量国外医学输
14、血及血液学分册2005年第28卷第6期与血浆中vWF多聚物的残留呈负相关这一理论基础建立了检测vwF:Rco推算ADAMTS13活性的方法.该方法在预处理条件上同样要求低离子缓冲液,BaC12活化和尿素变性.透析反应结束后,使用商业化的试剂盒检测vWF:R:cof.我室使用苏州系列单抗建立了该方法.该指标检测ADAMTS13活性,在方法评估中该方法检测值和预期值的一致性最高,r高达0.98,并且CV值低,对于ADAMTS13活性缺陷检出率高,是最稳定的方法之一_7.现将ADAMTS13活性检测方法总结如下:见表1.表lADAMTS13检测方法和评估简表:十二烷基磺酸钠一琼脂糖凝胶电泳4影响因素
15、有关ADAMTS13活性检测的方法报道了很多,在TTP和溶血性尿毒症(HUS)及一些疾病的鉴别问题上,有学者认为由于使用不同方法检测,故得出了不同的结论.Tsai_】坚持认为直接检测裂解底物的试验方法最为可靠,他应用此类的方法发现TTP患者ADAMTS13活性严重缺乏,而HUS不减低,虽然有一些临床诊断为TTP的患者ADAMTS13活性不低,可能是由于不同的发病机制所致,不应诊断为TTP.Tsai_】为此提出以ADAMTS13活性减低为标准诊断TTP.Studt等.先后于2003,2004两年,组织了多中心参与的检测方法评估,对于ADAMTS13活性严重缺陷时检出率较好的为经典的多聚物检测,经典的残余CBA(定量法)以及瑞斯托霉素辅因子检测.并且后两者检出值与实际值的一致性最好,瑞斯托霉
