蛋白质纯化(1)

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1、蛋白质纯化词条已锁定2012-0808 13:39 词条被编辑 完善摘要目录1蛋白质纯化 2内容提要 2.1亲和纯化样品的前 2。2亲和纯化步骤 目录1蛋白质纯化 2内容提要 2。1亲和纯化样品的前 2.2亲和纯化步骤 收起 蛋白质纯化 蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝.为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。其蛋白质分离纯

2、化主要方法包括：（1） 根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜）；密度梯度离心(蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）;凝胶过滤(一种柱层析）（2） 利用溶解度差别分离：等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零,减少了分子间静电斥力,因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小）；盐溶与盐析（利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度）(3) 根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离;（4） 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）(5) 根据配体特性的分离亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地

3、结合这一生物性质）内容提要 一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积起始目的蛋白量2. 细菌裂解获得可溶蛋白 BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 机械破碎（如超声等）Ni-NTA 树脂纯化 二、亲和纯化步骤1。 NiNTA树脂的兼容性2。 天然条件纯化 柱层析 FPLC 批次小量纯化3。 变性条件的纯化 柱层析 FPLC 纯化 批次小量纯化4。 树脂再生5。 常见问题与改善建议 一、亲和纯化样品的前处理 1. 菌液体积-起始目的蛋白量纯化条件的优化需考虑多个因素，包括HisTag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达,需要采用一个较高的浓缩系数（concentra

4、tion factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。例如，某蛋白表达水平约为0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则100ml 的培养物离心获得的菌体，按浓缩100 倍比例重悬于含变性剂的1ml 裂解/结合缓冲液中。在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用50-100 倍浓缩。 表1 确定所需菌液体积 HisTag融合蛋白浓度表达水平培养体积 HisTag融合蛋白总

5、量浓缩系数(在1ml溶液中裂解后）变性条件50mg/L 40 3ml 150g 310mg/L 8 10ml 100g 102mg/ L 1.6 25ml 50g 250.5mg/ L 0。4% 50ml 25g 500。1mg/ L 0.8 100ml 10g 100天然条件1mg/ L 1 50ml 50g 501mg/ L 1% 100ml 100g 100与其它亲和纯化介质一样,HisBind 树脂在接近其结合载量时使用,可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDSPAGE，Western blot，

6、STagTMRapid Assay，FRETWorksTM STag Assay 等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。 2. 细菌裂解获得可溶蛋白 BugBuster Master Mix蛋白抽提方法BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂,有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和500ml包装分别足够用于20g和100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提.可溶蛋白

7、制备采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考Novagen的TB055“PET系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法.渗透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。1。 用经预先称重的离心管10，000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1。5ml或更少），可以用1。5ml离心管14，00016，000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。2。 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml抽提试剂。这相当于50ml培养液采用2。5

8、ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀(例如，1.5ml培养液采用300l抽提试剂）.如果抽提试剂过量也没有什么副作用。选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号69671）,Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理,就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂,建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤. 3。 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。 注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。4。 4下16，000g离心20分钟以去除不溶的细

9、胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）的材料。5。 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（23小时）,也可在20长时间存放直至下步分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。 高纯度包涵体的制备 以下操作可用于任何BugBuster系列产品抽提的包涵体纯化.1。 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。2。 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584),BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。吸打并涡旋以获得均

10、匀的悬浮液。充分重悬沉淀能够溶解、去除杂蛋白以获得高纯度的包涵体.3. 加入rLysozyme溶液至终浓度为1KU/ml。温和涡旋混匀，室温孵育5分钟.注意：如果采用的是BugBuster Master Mix就不需要另加rLysozyme了(即可省去此步操作）。4。 加入6倍体积的经1：10去离子水稀释的BugBuster重悬，涡旋1分钟混匀。5. 于4，5,000g离心15分钟，以吸管移去上清，收集包涵体。6. 将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1：10稀释的BugBuster中，涡旋混匀,如步骤5离心.此步骤重复两次。再次重悬,于4,16,000g离心15分钟并去除上清。7。 重

11、悬最终的沉淀（即纯化的包涵体）于选定的缓冲液,最好是能与后续纯化方法兼容的缓冲液。包涵体可以重悬于Novagen的蛋白重折叠试剂盒（货号70123）中的1溶解缓冲液（参考操作手册TB234）或其它变性剂。不溶的HisTag融合蛋白可以用含有变性剂的1结合缓冲液重悬用于HisBind纯化（IDA或NTA）。 机械破碎(如超声等） 可溶蛋白的制备稀释8储液制成1结合缓冲液,或按照缓冲液成分列表自己配制（参考Novagen 目录或树脂英文说明书）.1. 10,000g 离心10 分钟收集菌体.弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入4ml (1:25 v/v)缓冲液,重悬于冰浴预冷

12、的1结合缓冲液或1Fractogel 结合缓冲液中.也可加入NP-40 或其他非离子型去污剂至终浓度0。1，以减少非特异性结合。若细菌菌体重悬困难，可使用匀浆器、搅拌器或超声仪帮助打散菌体。2. 将重悬菌液置于合适大小的容器中，超声破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或盐冰浴中.超声条件依赖于所使用的超声仪功率、探头种类、容器的大小形状,须实验者自己摸索。应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间、多次超声。通过一定的间隔时间避免溶液过热。若DNA 未能被超声剪切，裂解液会十分粘稠，可能阻塞色谱柱，降低流速，影响后续的纯化过程。大量的菌体可选用弗氏压碎法(French Press）。 包涵体的制备

13、 使用1结合缓冲液从大肠杆菌中分离、洗涤包涵体，除去杂质蛋白，再用含6M 盐酸胍或6M 尿素的1结合缓冲液溶解包涵体。1. 10,000g 离心10 分钟收集菌体。弃上清,尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入40mI 1结合缓冲液比例重悬菌体。此步骤不加变性剂。2。 按前述方法进行超声,重悬菌液，剪切降解核酸。3。 5，000g 离心15 分钟，包涵体和细胞碎片位于沉淀中.其他可溶蛋白部分位于上清中。4。 移去上清，每100ml 培养物的沉淀重悬于20ml 1结合缓冲液，重复第3 步。可能需要超声以彻底重悬沉淀.注意: 本步操作可加入rLysozymeTM溶液(非必要）帮助处理包

14、涵体。已证实溶菌酶可消化细胞壁，提高包涵体纯度。将rLysozyme 加入1结合缓冲液至终浓度1KU/ml，轻柔混匀，孵育5-10 分钟即可离心.5。 移去上清，按每100ml 培养物加5mI 缓冲液比例，加入含6 M 盐酸胍或6 M 尿素的1结合缓冲液重悬沉淀。6. 冰浴孵育1 小时，彻底溶解包涵体。16,000g 离心30 分钟去除不溶成分，HisBind 纯化之前用0.45um 滤膜过滤上清。 二、亲和纯化步骤 Ni-NTA 树脂纯化Ni-NTA HisBind 树脂不能耐受高浓度还原剂，如DTT、DTE，这些还原剂会还原Ni 离子，使其无法与HisTag融合蛋白结合。被还原的树脂呈棕色

15、。多数情况下,可以使用巯基乙醇,其浓度可以加至20mM.EDTA、EGTA,或其它强螯合剂会与Ni2+结合,将其从树脂上剥离下来。Ni2+被螯合后，树脂呈白色。对任何还原剂或螯合剂，请小心对待。若不能确定，请先在小量树脂上进行试用。应尽量避免缓冲液中含有任何高浓度供电子基团成分（如NH4+)、或裂解物中含诸如Arg、GIn、Gly、His 等氨基酸.菌体应在无强螯合剂(如EDTA)、无强还原剂(如DTT）、无离子型去污剂(如SDS)的情况下裂解。尽管确实存在某些例子，在这些试剂存在的情况下成功纯化出目的蛋白，但还是建议大家避免使用这些试剂。更多信息请参考2. 2. 天然条件纯化 在决定使用天然条件（非变性条件）进行蛋白纯化之前，首先需要确定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不溶形式表达，仍有可能有少量可溶蛋白可以用 NiNTA HisBind 树脂纯化出来。在没有强变性剂如尿素