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1、实验 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的要求1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。二、实验原理细菌的菌体很小，活细胞的含水量在8090，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。本实验只学习前两种。简单染色法 是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。革兰氏染色法 是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类
2、。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验器材菌种：培养24小时的大肠杆菌染色剂和试剂：石炭酸复红染色液，革兰氏染色液(草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)， 香柏油、二甲苯器材和器皿：显微
3、镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，接种环，擦镜纸，吸水纸，火柴，小烧杯，玻片架、试管、小滴管等四、操作方法1、简单染色：（1）涂片：取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序，挑取大肠杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多；涂片必须均匀；涂布面积直径约1.5cm为宜；挑取菌种时切勿将培养基挑破。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意
4、冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95
5、%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。五、实验报吉1、绘出你所观察到的经单染色的大肠杆菌形态图。2、绘制大肠杆菌革兰氏染色视野图。六、思考题1、涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么?2、革兰氏染色法的染色过程应注意什么?
