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1、细胞体外培养实验流程一、 细胞复苏1. 准备：紫外照台30min，准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基（含FBS），水浴箱开启到37，75%乙醇清洗双手，培养基用前37温育20min，酒精擦拭后放入无菌操作台，点燃酒精灯。2. 灼烧离心管管口、塞子和滴管，用滴管取5mL培养基加入离心管中。3. 戴好防护用具，从液氮中取出冻存管后立即放入37水浴箱中，轻轻摇晃冻存管，保证细胞1min内融化。以75%酒精擦拭冻存管外部，移入无菌工作台。4. 用吸细胞液的从冻存管中将细胞悬液完全吸出加入到已装有培养基的离心管中，塞子塞离心管，2000rpm，离心4min，弃上清。5. 往离
2、心管中加培养基（含FBS）5mL，用吸细胞悬液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，将离心管中的细胞悬液全部吸出加入到培养瓶中，培养瓶平放，轻轻晃动，使细胞均匀贴壁，标记好细胞名称、日期、培养人，放入37，5%的CO2恒温培养箱培养。6. 收拾所用物品，75%酒精喷洒消毒。注意：1. 离心时转速太高，离心时间过久都易对细胞造成伤害。2. 滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞污染。3. DMSO常温下对细胞毒性较大，故冻存细胞复苏后应立即洗涤冷冻保护剂。二、 细胞换液1. 将培养瓶从CO2培养箱中取出，倒置显微镜下观察细胞生长状态（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内。2. 准备：紫外照台
3、30min，准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基（含FBS），水浴箱开启到37，75%乙醇清洗双手，培养基用前37温育20min，酒精擦拭后放入无菌操作台，点燃酒精灯。3. 酒精灯外焰灼烧培养瓶瓶口、瓶塞和滴管，培养瓶倾斜，吸出旧液，尽量吸净。4. 吸取培养基（含FBS）5mL，加到培养瓶中（FBS终浓度为10%）。（若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基。）5. 将培养瓶与瓶盖过火，旋紧瓶塞后回旋半圈，平放回CO2培养箱。6. 收拾所用物品，75%酒精喷洒消毒。注意：1. 打开和盖紧培养基、培养瓶前后均需旋转灼烧瓶口和瓶盖。2. 各滴管一定要严格分开，不能混
4、用。3. 将PBS注入到培养瓶中，应将液体打到没有细胞的那一面。4. 培养液以没过细胞为宜。整理为word格式5. 细胞溶液变黄或死细胞过多时换液。6. 倒掉培养瓶中的培养液，瓶口应尽量远离废液缸，以免造成污染三、 细胞计数和活力测定（一）细胞计数 细胞数/mL=4大格细胞总数/4104稀释倍数1. 紫外照台30min，75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。2. 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中吸出少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，静置3min。3. 观察计数：压线的记左不计右，记上不记下，成团细胞只记为1个。先用4倍镜找出大位置，再用10镜
5、计数。4. 计数完用75%酒精棉签擦洗盖玻片和计数板。（二）细胞活力测定1. 紫外照台30min，吸取细胞悬液0.5mL加入试管中。2. 加入0.5mL 0.4%台盼兰染液，染色23min。3. 吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。注意：1. 细胞计数时盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边凹槽中。2. 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。四、 细胞传代1. 配完全培养基：基础培养基:FBS=1:92. 取出细胞，
6、显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代。3. 紫外照台30min，75%酒精擦拭双手，将预热后的培养基、PBS、胰酶培养基等用酒精擦拭后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台。4. 点燃酒精灯，将培养瓶用75%酒精擦拭后移入工作台，将瓶口和瓶盖过火灼烧。5. 在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，用适量PBS清洗细胞表面，并弃去PBS。6. 加入1mL 0.25%胰酶消化细胞，此时可将细胞置于37细胞培养箱内消化。胰酶以铺平培养瓶底部为宜。倒置显微镜下观察，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度（一般2-5min）。立即弃去消化液加入
7、3mL完全培养基终止消化。（注意更换吸管）整理为word格式7. 用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略，把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入离心管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。8. 取一滴细胞悬液进行计数，计算好细胞传代培养时稀释倍数（细胞传代密度不低于5105个/mL。9. 传代：先用滴管吹打混匀细胞悬液，按一定比例稀释，标记好细胞名称，传代培养时间，培养员，细胞个数，平放入CO2培养箱继续培养。10. 收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台。附：培养细胞若需给动物注射，在消化后用PBS清洗3-5次后收集细胞并计数，用PBS清洗细胞是为防止给动物注射时
8、残留的FBS造成动物炎症。注意：1. 对于难消化的细胞在用胰酶消化前，先用12mL 4 PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤。2. 一定要防止细胞过消化！因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。*过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下来的细胞。b.培养瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培养瓶底板有一片片空隙。出现过消化时立即加入含FBS的培养基终止消化。3. 把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细胞成团不
9、均，用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害，影响在培养瓶中生长。5. 一般细胞生长铺至瓶底约80%，则可传代或用来做实验，否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化，不易用于后续实验。五、细胞冻存1. 选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1天换半量或全量培养基。与冷冻细胞应生长良好且存活率高，约为80-90%致密度。2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、FBS（10%），逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。3. 依细胞传代培养的操作，收集细胞于离心管中，取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率，一般细胞冻存浓度为1-51
10、06个/mL。4. 离心管管口和管塞过火灼烧，塞好后，2000rpm离心4min，去上清，加适量完全培养基，混匀。整理为word格式取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为510），使细胞浓度为15106 cells/mL，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，12mL/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。5. 4静置10min，-20静置30min，-80过夜放置，液氮槽冷冻保存。6.7. 8. 友情提示：本资料代表个人观点，如有帮助请下载，谢谢您的浏览！9. 10.11. 12.13.整理为word格式
