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1、山东理工大学乳酸发酵与乳酸菌饮料的制作学院：生命科学学院班级：生物工程0901 班成员：张强(0911071008)张志豪(0911071010)李桂军(0911071022)乳酸发酵与乳酸菌饮料的制作摘要：取适量新鲜酸乳稀释后接入BCG牛乳培养基，选取圆形稍扁平的黄色菌落，初步定 位乳酸菌。选取典型菌落转至脱脂乳试管中培养并观察是否出现凝乳现象，并从能够凝乳， 无气泡，呈酸性的试管中挑取样品涂片镜检，进行革兰氏染色，确定为乳酸菌后传代培养， 选出菌种进行乳酸发酵及检测。再利用市售新鲜酸乳为发酵剂接入制作饮料的培养基质，制 作乳酸菌饮料。关键词：酸乳 乳酸菌 分离纯化 乳酸发酵 酸碱滴定 引言
2、：许多种类的微生物（主要是细菌）在厌氧条件下分解己糖产生乳酸的作用称为乳酸 发酵。能利用可发酵糖产生乳酸的细菌称为乳酸细菌。乳酸细菌多是兼性厌氧菌，在厌氧条 件下经过 EMP 途径，发酵己糖进行乳酸发酵。生活中酸乳中常见的乳酸菌有保加利亚杆菌 和嗜热链球菌等。酸乳是一种常见的乳酸饮料，它是以牛乳为主要原料，加入一定的糖类， 接入一定量的乳酸菌，经过发酵后而制成的饮料。本次实验的目的是学习乳酸发酵和制作乳 酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。1. 乳酸菌的分离纯化1.1 乳酸菌的分离1.1.1 BCG 牛乳培养基的配制BCG牛乳培养基的制备比例见下（100mL）：A溶液：脱脂乳粉20g水100
3、mL1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇0.2mLB溶液：酵母膏2g水100mL琼脂4g其中A溶液80C灭菌20min, B溶液调pH6.8, 121C湿热灭菌15min,无菌混合倒平板。1.1.2 梯度稀释（无菌操作） 所需仪器：试管（7 支）、移液器、枪头。需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头用量程为1000的移液管从市售新鲜酸乳中吸取1ml酸乳加入盛有9ml无菌水的试管 中充分混匀。然后换枪头从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均 匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5,10-6不同稀释度的酸乳稀释液。1.1.
4、3 涂布平板将释倍数分别为10-4、10-5、10-6的样品溶液涂布到BCG牛乳培养基上，37.5培养48h。选取圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定位乳酸菌。1.2 乳酸菌的鉴别与传代培养1.2.1 脱脂乳试管的制备直接选用脱脂乳粉与5%蔗糖水为1:10比例配制，装量为试管的1/3, 115C灭菌15min 备用。1.2.2 乳酸菌的鉴别选取选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，37.5C培养 箱中培养824h，观察其中牛乳是否出现凝固。1.2.3乳酸菌的传代培养选取上述步骤中的乳酸菌，接入脱脂乳试管中，连续传代培养 46 次，最终选择出在 36h 能凝
5、固的牛乳管，作为菌种待用。2. 乳酸发酵及检测2.1 乳酸的发酵2.1.1 乳酸菌培养液的制备乳酸菌培养液的制备比例见下：牛肉膏5g酵母膏5g蛋白胨10g葡萄糖10g乳糖5g水1000mL按照以上比例配制600mL培养液，调pH至6.8， 121C灭菌20min。2.1.2 乳酸菌的接种与培养在无菌操作下将分离的一株乳酸菌接种于装有300mL乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，置于37.5C静止培养。2.2 乳酸发酵的检测为了便于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每68h取样分析，测 定pH。另一组在接种培养24h后每瓶加入CaCO32.5g （以防止发酵液过酸使菌种死亡），每 6
6、8h 取样，测定乳酸含量（酸碱滴定法），记录测定结果。3. 乳酸菌饮料的制作3.1 乳酸菌培养基的制作将脱脂乳和水以1:7 （W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于8085C灭 菌1015min,冷却至3540C，作为制作饮料的培养基质。此外还选取了市售纯牛奶作 为另一种培养基质使用。3.2 接种以市售新鲜酸乳为发酵剂，以 2%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液。 接种后摇匀，分装到以灭菌的三角瓶中，重复分装3瓶，随后将三角瓶密封。3.3 发酵将接种后的酸乳瓶置4042C培养箱中培养34h时。培养时注意观察，出现凝乳后 停止培养。然后转入45C冰箱中冷藏24h以上。经此后熟
7、阶段,达到酸度适中（pH44.5）, 凝块均匀致密,无乳清析出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。4. 结果与分析4.1 乳酸菌的分离我们蘸取为 10-4、10-5、10-6 三个稀释度接种到六个培养基培养后，有三个培养基上 长出少量黄色菌落（图 1），初步鉴定为乳酸菌落；图14.2 乳酸菌的鉴别选取牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性的试管，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），进行革兰氏染色发现其显阳性（图 2、图 3），认定此菌为乳酸菌。图2图34.3 乳酸菌的传代培养选择出在36h能凝固的牛乳管（图4、图5）,作为菌种待用。图4图54.4 乳酸发酵的检测A组（不加CaCO3）：接
8、菌后8h后，上清液PH值为5.5； 13h后上清液PH为4.5.（原始 发酵液 PH 为 6.8， PH 值均用 PH 试纸测定）B组（加CaC03）：加CaCO3后13h后，进行酸碱滴定（由于实验室药品及仪器限制， 本实验以甲基红为指示剂，用移液枪每次加10微升0.1摩尔每升的NaOH溶液），滴定结果 为 480 微升， 500 微升， 460 微升。结果分析发现，乳酸和CaCO3发生反应，故不能用酸碱滴定测B组的乳酸含量，另外还 有时间不够等原因无法重做本实验，所以本实验没测的乳酸的含量。4.5 评定酸乳质量在我们制作出的酸乳中，用市售的纯牛奶作为培养基质的酸乳味道较淡，而用脱脂乳粉 配制
9、的溶液作为培养基质的酸乳味道较浓。图65. 实验收获通过本实验我们分离得到了较纯净的乳酸菌，并对它们的发酵情况进行了鉴别和检测。 同时我们还自己制作了乳酸菌饮料。在进行实验的同时，复习了培养基的制作，接种，以及 超净工作台的使用和维护，练习了高压蒸汽灭菌锅的使用方法，锻炼了与各位同学的分工合 作能力。但实验中还存在有很多不足，由于我们实验之前没有充分的准备，导致走入很多误区， 比如第一次配制 BCG 牛乳培养基时，灭菌温度过低，未接种菌时就生长了许多杂菌；还有 乳酸发酵实验中乳酸的定量测定，由于没有考虑周全，导致最后结果不准确，数据不能使用参考文献1. 诸葛健，王正祥.工业微生物实用技术手册.北京：中国轻工业出版社，19942. 赵斌，何绍江.微生物学实验.北京：科学出版社，20023. 吕瑞芳.工业微生物.北京：人民卫生出版社，20054. 黄秀梨，辛明秀.微生物学实验指导.北京：高等教育出版社，2008
