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1、纳豆酱油的生产研究生命科学学院 生物技术专业 2007级 李学容指导老师 王汉臣摘要：研究了一种采用米曲霉、纳豆芽孢杆菌混合发酵技术制作酱油的新工艺。试验结果表明：米曲霉发酵适宜温度60，发酵时间3642 h，发酵的大豆氨基氮含量高，香味好；用纳豆芽孢杆菌进行二次发酵最佳条件为：发酵温度36，接种量1%，发酵时间30 h。采用混合发酵技术制作的纳豆酱油具有较高的纳豆激酶活性和中国酱油香味。关键词：米曲霉；纳豆芽孢杆菌；发酵Abstract: A new processing technology using Aspergillus oryzae and Bacillus natto for S
2、oy sauce was studied. The exper-imental result showed that the optimum saltless fermentation conditions for Aspergillus oryzae were as follow：Fermentationtemperature 60，fermentation time 3642h，the fermented soybean of higher amount NH2-N，good perfume. The optimum fermentation conditions for Bacillus
3、 natto were 36，1%inoculum size and3642 h fermentation time.Natto of higher Nattokinase activity and Chinese soy sauce perfume could be obtained byusing Aspergillus oryzae and Bacillus natto mixed fermentation technique.Key words: Aspergillus oryzae；Bacillus natto；Fermentation纳豆（Natto），一种大豆发酵食品，其生产主要
4、利用的微生物是枯草芽孢杆菌。纳豆激酶（Nattokinase，简称NK）是纳豆（Natto）在发酵过程中，由纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶1，该酶不但具有明显的溶栓活性，而且还可以激活体内的纤溶酶原，增加内源性溶纤酶的含量，具有降血压、抗氧化、抗肿瘤及重要的溶解血栓等医药功效，与传统的溶栓制剂相比，有不易引起出血、无抗原性、半衰期长、安全无毒且成本低廉和能口服吸收，溶栓等优点2，因而具有广阔的开发前景。纳豆是日本传统的发酵食品，但其所具有的特殊氨味不符合大多数中国人的饮食习惯，所以在中国的市场并不大。但酱油是人们日常生活中不可或缺的调味品，所以我们
5、预在米曲霉制曲中添加一定比例的纳豆芽孢杆菌发酵制得酱油，使制得的酱油含有普通酱油所没有的纳豆激酶。酱油是以蛋白质原料和淀粉质原料为主料，经微生物发酵酿造而制成的。目前，普通酱油的主要蛋白质原料是黄豆，淀粉质原料是面粉。而在目前对纳豆的研究中表明，以面粉作碳源生产的纳豆，几乎无真正纳豆的特征，这违背了我们想要让酱油中含有纳豆激酶的初衷4。而用糯米作碳源生产的纳豆，最重要的特点即是有效改善了由全黄豆发酵产生的那股很难让人接受的氨臭味，且不苦，若配以适宜口味的香精，调味料，是很容易被大众接受的4。这也克服了只单从调味料和香精香料来掩盖不良气味的局限。所以在纳豆酱油的酿造上，我们将采用一定比例的糯米作
6、为碳源，来改善苦味和氨臭味。另外，在碳源含量比例为10%条件下能有效抑制纳豆散发出的氨臭味 4。所以，在纳豆酱油的生产研究中，糯米所占的比例也是我们需要研究的一个问题。本实验旨在通过对酱油混合发酵技术的研究，找出一种制作酱油的新方法，促进酱油生产和消费。1 实验材料与方法1.1 实验菌种纳豆芽孢杆菌；米曲霉1.2 实验试剂尿激酶标准品、牛纤维蛋白原、凝血酶（生化试剂）、琼脂糖溶液1.3 实验原料黄豆、糯米、麸皮，均市场上购买1.4 实验设备恒温振荡培养箱（LRH-250Z，广东省医疗器械厂）、生化培养箱、超净工作台、压力灭菌锅、台式离心机、水浴锅、移液枪、分光光度计等1.5 培养基米曲霉培养基
7、：麸皮40克，米糠10克，水40ml；纳豆芽孢杆菌培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母浸出液、1%NaCl、PH自然1.6 实验方法1.6.1 纳豆酱油混合发酵技术流程米曲霉制种曲黄豆清洗浸泡蒸煮冷却接种制曲洗霉发酵纳豆芽孢杆菌发酵浸出取油纳豆芽孢杆菌扩大培养1.6.2 米曲霉发酵称取黄豆三份，每份210 g，将其清洗干净，用3倍的清水浸泡6 h，平铺待其较干燥后，每份加90 g麸皮，121高温灭菌处理30 min，冷却后接种米曲霉，装入灭菌的纱布中，再置于平坦的竹匾上，平铺，用灭菌的筷子和匀，盖上灭菌的报纸培养，至长满米曲霉绿孢子（培养结束），温水洗霉后滤干水分，置于三个玻璃容器中，分别置于60
8、、65、70恒温水浴发酵。1.6.3 纳豆芽孢杆菌发酵1.6.3.1 液体种子制备500 mL三角瓶分装100 mL纳豆芽孢杆菌培养基，接种后在温度30、转速140 r/min条件下振荡培养16 h，得种子液。1.6.3.2 纳豆芽孢杆菌发酵将米曲霉发酵后的黄豆接种纳豆芽孢杆菌进行二次发酵，以发酵温度、接种量和发酵时间作三因素四水平的正交实验，实验方案见表1。以产品中纳豆激酶活性为测定指标，同时检测氨基氮含量，选择最佳发酵条件。表1 最适发酵条件正交试验设计方案水平 A（发酵温度/oC） B（接种量/oC） C（发酵时间/h） 1 28 1 182 32 3 243 36 5 304 40 7
9、 361.6.3.3 另称取三份黄豆，每份210 g，经上述方法进行米曲霉发酵，在进行纳豆芽孢杆菌发酵时，在其中分别加5%、10%、15%的糯米，以比较最终制得酱油的口感与气味。1.6.4 氨基氮测定用甲醛法。1.6.5 纳豆激酶检测取20 g经纳豆芽孢杆菌发酵后的黄豆，加20 mL生理盐水拌匀，在低温（4）条件下提取1 h，吸取0.5 mL提取液于离心试管中，10 000 r/min低温（4）离心10 min，取其上清液待用。制琼脂糖-纤维蛋白平板：取1%琼脂糖溶液16.2 mL，在45水浴中保温30 min，然后将1.3 mL凝血酶溶液倒入琼脂糖中，混匀后再加入在45水浴中保温5 min的
10、纤维蛋白原溶液16.2 mL，充分混合后立刻倒入培养皿中，室温放置1 h，即得琼脂糖-纤维平板。然后在平板上打直径2 mm的孔，每孔点离心上清液样品10 L，静止10 min，37恒温培养18 h，测量溶圈大小。以尿激酶为标准曲线，计算纳豆激酶活性5。1.6.6 浸出取油加16oBe/25oBe/的盐水按重量百分比为30%80%的比例于玻璃容器中，静置2440h后，压榨制得纳豆酱油。2 结果与讨论2.1 米曲霉发酵 图1 不同温度和发酵时间对氨基氮生成量的影响试验结果表明：在60条件下，氨基氮生成量较多。65和70条件下，氨基氮生成量下降这是由于蛋白酶在60条件下活性较高，有利于蛋白质的降解;
11、低于60发酵，容易引起污染，难以保证米曲霉发酵的正常进行，因此，60是米曲霉发酵的适宜温度。发酵时间642 h，氨基氮含量逐渐增加，42 h后趋于稳定。由于考虑要进行二次发酵,故选择发酵时间3642 h为宜。2.2 纳豆芽孢杆菌发酵2.2.1 培养条件对纳豆芽孢杆菌生长的影响如图2所示，培养温度3045时，纳豆菌生长良好，菌数增长也较好，在该温度范围内净生长量相差不大。当温度低于30或高于45时，净生长量均有所下降，说明该菌种适宜培养温度为3045。图2 不同温度对纳豆芽孢杆菌生长的影响如图3所示，接种量为0.5%时能满足菌种生长量要求;接种量0.5%2%之间，菌数净生长量增长较快；接种量0.
12、5%7%时，随着接种量的增大，生长量逐渐增加。图3 不同接种量对纳豆芽孢杆菌生长的影响如图4所示，培养时间1224 h时，菌种净生长量呈上升趋势，24 h以后净生长量有所下降，然而当培养至48 h后出现OD值上升。说明培养24 h菌数达到稳定期，48 h后OD值上升，菌体逐步衰老自溶，经显微镜检查，菌体不规则，边缘不清晰，出现菌体自溶现象。因此，24 h为该菌种适宜的培养时间。图4 不同培养时间对纳豆芽孢杆菌生长的影响2.2.2 纳豆芽孢杆菌发酵以发酵温度（）、接种量（%）和发酵时间（h）进行纳豆芽孢杆菌发酵正交实验，因素水平及结果见表2。从表2纳豆激酶活性结果分析可知，影响纳豆芽孢杆菌发酵因
13、素主次顺序依次为A（发酵温度）、C（发酵时间）、B（接种量）。确定A3B1C3为最佳工艺条件，即发酵温度36、接种量1%和发酵时间30 h，成品纳豆酱油中纳豆激酶活性314.30 IU/g，氨基氮含量0.846%。表2 L16(43)正交实验结果分析表试验号因 素纳豆激酶活性/IUg-1氨基氮/%A B C1 1 1 1 232.5 0.8712 1 2 2 265.3 0.8063 1 3 3 271.8 0.7244 1 4 4 208.1 0.8135 2 1 2 297.7 0.7426 2 2 1 243.2 0.7167 2 3 4 233.8 0.8418 2 4 3 256.3 0.8759 3 1 3 314.3 0.84610 3 2 4 238.2 0.87111
