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1、摘要：本实验以土壤中的微生物作为原材料，根据微生物各自的生长特点，配制不同成分的微生物培养基。将微生物培养物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到培养基上培养，在分离出相应微生物后，对其进行进一步的纯化，然后观察其形态特征，并通过微生物的生理生化反应对其种类进行鉴定，最后研究环境条件对微生物生长的影响。 关键字：培养基，分离，纯化，鉴定，环境条件一、 实验材料1、分离细菌、真菌、放线菌的材料：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。新鲜土壤；培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（1
2、0mL装）；试剂：5000U/mL链霉素液、0.5重铅酸钾液。2、细菌、真菌、放线菌纯化与鉴定的材料：菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌，前实验分离的未知菌；培养基：淀粉培养基、硫化氢实验培养基、石蕊牛乳培养基、油脂培养基；试剂：碘液。菌种：枯草杆菌斜面；灵杆菌菌液；黑曲霉斜面。培养基采用：牛肉膏蛋白胨斜面培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（10mL）、马铃薯蔗糖培养基（10mL）、淀粉琼脂培养基（10mL）；供试药剂：2.5碘酒，75酒精，0.1HgCl2，5石炭酸。二、实验步骤1、分离细菌、真菌、放线菌的步骤（一）、培养基配制l. 培养基配制的一般方法和步骤（1）称量：按照培
3、养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水），用玻棒搅匀，加热溶解。（3）调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调），用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。（4）加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。（5）分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的15 特别注意不要使培养基粘污在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（6）包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称
4、的标签。（7）灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面（见图6-1）。培养基经灭菌后，必须放在37恒温培养箱中培养 24h，如确无菌生长、方可使用。2三种培养基的配方及具体配制方法（1）. 牛肉膏蛋白陈琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）。配方：牛肉膏 3g蛋白胨 5g氯化钠3g琼脂20g自来水1 000mLpH7.2 7.4灭菌l.05kgcm2，2530min本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30牛肉膏、50蛋白胨、30氯化钠。以配制200mL培养基为例。吸取30牛肉膏2mL；50蛋白胨2mL；30氯化钠2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补
5、足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调 pH至 7.4，加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，（见图62）。装带有棉塞的无菌试管，装置15的试管高度共12支，作斜面培养基、用铝壳试管帽的里装10mL。约试管高度的 12以上，用作分离时倒平板用。分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆（图6-3），挂上标签，灭菌备用。（2）. 马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基）。配方：去皮马铃薯（或鲜豆芽）200g蔗糖（或葡萄糖）20g自来水1000mL琼脂20gpH天然灭菌（含蔗糖）1.05kg/cm2
6、20min（含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min制备方法配制200mL培养基为例取上皮马铃薯40g，切成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置电炉上加热煮沸10min，用4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200mL。然后加蔗糖4g，加琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。（3）. 淀粉琼脂培养基（高氏一号GauseI），用干分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方：可溶性淀粉 20.0gKNO31.0g K2HPO4 0.5gMgSO47H2O 0.5gNaCl 0.5gFeSO47H2O 0.01g琼脂20g自来
7、水1 000mL灭菌1.05kg/cm230min制备方法配制（以配制200mL）培养基为例：吸取配方液：1KNO320mL；1K2 HPO410mL；1MgSO47H2 O10mL；lNaCl10mL；1FeSO4 7H2O0.02mL加水补足至 200mL，置电炉上加热.用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4g，从200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，调pH至 7.4，加琼脂 4g，加热至琼脂完全溶化为止，趁热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。3. 无菌水的制备无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用而准备。100mL三角瓶（装有
8、玻璃珠），装自来水45mL，试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。（二）分离培养微生物常用器皿的准备1. 清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，培养皿、吸管等。2. 棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，（约1-1.5cm 长）以防止细菌吸入口中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。3. 包装培养皿和吸管等。为了使培
9、养皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当（见示范），每组同学包培养皿6只（一包）。吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在45cm宽的长纸条的一端，约成45角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。（三）微生物的分离1. 用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。（1）制备土壤稀释液无菌操作过程见教师示范。A. 取土壤5g，放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10-1的土壤悬液。B. 另取装有9mL无菌水试管5支，
10、用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌吸管吸取 1mL土壤悬液加入 10的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法由10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6土壤稀释液。在土壤稀释过程中，以用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图7-1。图71 检样的稀释方法（2）每组取无菌培养皿2付，即每个同学做一只。学号单号学生用10-5稀释度液，双号学生用10-4稀释度液。先在无
11、菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。取另一吸管，以无菌操作法吸取10-4或10-5土壤稀释液1mL，加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加入 2滴 5 000U/mL的链霉素液。此时严防两液相混。取已融化在水浴锅中保温50oC左右的马铃薯蔗糖琼脂培养基2 管（10mL装，一管倒一皿），以不烫手为准，倒入上述培养皿中（见图7-2），轻轻转动培养皿，使菌液、链霉素液、培养基充分混匀铺平皿底，放在平坦的桌面上，凝固后，翻转培养血，置2830oC恒温培养养56d。观察真菌菌落形态以及计数菌落数。并计算出每1g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即
12、得。（3）挑取单个菌落接种到外面培养基上作纯化和性能测定，若不纯，需要继续分离。2. 用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上）。每组取无菌培养皿2付（每个同学各做一只）。各在培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。以无菌操作法先在培养皿中加入0.5重铅酸钾溶液2滴，取已融化的淀粉琼脂培养基2管，分别倒入2付培养皿中，轻轻转动培养皿，使培养基与重铅酸钾充分混匀，铺平，制成平板。待平板凝固后，另取一支吸管吸取10-3（单学号学生）或10-4（双学号学生）稀释液0.2mL土壤稀释液放在平板上。取无菌三角玻棒，把上述稀释液在平板表面涂抹均匀（见图7-4）。在涂抹时不要弄破平板
13、，以免影响菌落的生长。翻转培养皿，置2830条件下培养67d，观察放线菌菌落形态及计数菌落，并算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯再移植或纯化，直至得到纯培养为止。3. 用平板划线法分离土壤中的细菌（土壤稀释液的制备同上）。（1）每组取无菌培养皿两付，同上法在培养皿底部贴上标签。取已融化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入无菌培养血中，制成平板。（2）平板凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10-5或10-6）在平板上划线（教师作示范）连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划法（图7-5），勿划破培养基。划线完毕后，倒置28oC30oC温
14、室培养。分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3- 4条，再转动培养皿约60”角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（见图7-5）划线完毕，盖上皿盖，倒置于28-30温室中培养。（3）挑取单个菌落接种子斜面培养基上，如果不纯再移植成纯化，最后得到纯培养。用上述分离土壤中真菌、放线菌和细菌的方法，也可用于分离病虫、病蚕或果蔬上的病原菌。以划线法从病蚕分离黑胸败血病病原菌为例，先用75酒精棉球进行表面消毒（注意病虫、病蚕、果蔬等分离
15、的样品不要过份腐烂，便于进行材料的处理。取灭菌手术剪剪去病蚕的一只腹足，流出体液作为划线分离的材料，若是分离苹果炭疽病病原菌，则用无菌镊子揭下有炭疽病苹果的果皮，再从此处切取米粒大小果皮1块，放入盛有1mL无菌水的试管中，用无菌玻棒捣碎制成悬浮液，划线法分离病原菌。图75 平板分离划线的方法A. 连续划线法B. 分区划线法2、细菌、真菌、放线菌纯化与鉴定的步骤（一）淀粉水解试验某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后遇碘不再变蓝色。试验时将装有淀粉培养基的三角瓶置于洗水浴中融化，然后取出冷却至约50左右，即倾入培养皿中，待凝固后制成平板。每个同学用接种环取少量菌涂在平板上，每个菌种涂片 0.30.5cm大小的圆（见图 9-1）、其中一种应以枯草杆菌（Bacillus subtilis）作为对照菌。图91 淀粉水解试验接种示意图1. 枯草芽孢杆菌 2. 试验菌1 3. 大肠杆菌 4. 试验菌2将培养皿倒置于37恒温箱中培养24h，观察时打开皿盖滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。（二）硫化氢
