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1、-微 生 物 实 验 教 案实验一 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。二、实验原理1 显微镜油镜使用的原理（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=/2nsin(/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间
2、的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m）n: 物镜和被检标本间介质的折射率。a：镜口角（即入射角）。3油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。四、实验方法与步骤（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。（2）调节光亮度
3、。（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。（6）绘出所观察到的细菌形态图像。（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。五、实验报告油镜使用的原理 绘制细菌形态六、思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同.应特别注意些什么.2使用油镜时，为
4、什么必须用镜头油.七、实验注意事项1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。6显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。八、教学反馈实验二细菌的简单染色一、实验目的熟练掌握显微镜油镜的使用方法。学习染色的基本技术，二、实验原理简单染色的
5、原理大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。2、培养12-18h的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。3、简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）四、实验方法与步骤1、活菌制片观察取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜
6、的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。2、简单染色(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。(3) 固定:于火焰上通过23次。(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色分钟。（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。（7）镜检：在油镜下观察细菌形态。五、实验报告油镜使用的原理 绘制细菌形态六、思考题1镜检
7、标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察.2根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项.七、教学反馈实验三 细菌的革兰氏染色一、实验目的1掌握革兰氏染色。2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验原理1革兰氏染色的原理革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽
8、提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。三、实验材料1大肠杆菌24h的斜面培养物。2葡萄球菌24h的斜面培养物。4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）5载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。四、实验方法和步骤附表1细菌染色法分类附表2 微生物染色常用染料A酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。B碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。C中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核
9、染色）。D单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料2革兰氏染色（1）涂片。（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。（5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。（6）镜检：观察染色结果。五、实验报告1 革兰氏染色的基本原理和意义2 革兰氏染色成败的关键六、思考题1根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项.2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观
10、察.3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚.其染色成败的关键一步是什么.4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠七、教学反馈实验四 培养基的配制一、实验目的1学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤2学会实验室灭菌锅的使用方法二、实验材料1牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO4.7H2O。2试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。3 灭菌锅三、实验方法(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配
11、制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10gNaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。1称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防
12、琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。5分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜。半固体培养基以试管高
13、度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。6加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约35塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。8灭菌：将上述培养基于121.3湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应
14、放人冰箱内暂存。9摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜度的长度不超过试管总长度的1/2。10无菌检查：将灭菌的培养基放入37温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内，备用。四、实验结果和报告记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。五、问题和思考1配制培养基有哪几个步骤在操作过程中应注意些什么问题为什么2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌若不能及时灭菌应如何处理.如何进行无菌检查，3试设计实验对饮料进行无菌检查。六、演示1培养基的分装方法。2试管斜面的搁置方法七、注意事项称药品用的牛角匙不要混用，称完药
15、品应及时盖紧瓶盖。调PH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。八、教学反馈实验五 土壤的稀释、分离、纯化及无菌操作技术一、实验目的和内容1学习从上壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。2用稀释法分离细菌、放线茵和霉菌。3用平板划线法分离微生物。4学习平板接种等无菌操作技术。二、实验材料1金黄色葡萄球菌和普通变形菌斜面菌种。2已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶。3无菌培养皿12套、无菌EP管10支、土壤样品、天平、称量纸、药匙、试管架、记号笔、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul枪头、200ul枪头、20ul枪头。4无菌水(49.5mL、带玻璃珠) 1瓶、80乳酸、10酚液、95乙醇。三、实验方法(一)土壤稀释分离1取土壤：取表层以下5-10ml处的土样放入灭菌的袋中备用，或放在4冰箱中暂存。2制备稀释液(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒人带玻璃珠的无菌水瓶中，振荡5-10min,使土壤充分打散，即成为10-2的土壤
