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1、毕业设计(论文)课 题 名 称 HPLC测定虎杖茎中虎杖苷含量的研究学 生 姓 名 学 号 系、年级专业 生物与化学工程系08级生物工程专业指 导 教 师 职 称 副教授 2012年5月16日II目 录摘 要IAbstractII前 言11 材料与方法411 材料、仪器与试剂412 对照品溶液的制备513 标准曲线的绘制514 超临界二氧化碳流体萃取工艺流程515 萃取物中虎杖苷含量的测定516 单因素试验617最佳萃取工艺条件实验设计62 结果与分析721虎杖苷对照品标准曲线的绘制722 单因素试验结果823 正交试验结果直观分析83 结论15参考文献16致 谢18HLPC测定虎杖茎中虎杖苷
2、含量的研究 摘 要目的:研究超临界CO2萃取压力、温度、时间和携带剂甲醇的添加量对虎杖茎中虎杖苷提取的影响，探讨虎杖茎中虎杖苷的最佳提取参数。方法:采用正交试验，用超临界CO2萃取虎杖茎中虎杖苷，并用HPLC和紫外分光光度计对提取液进行分析。结果:正交试验结果表明，影响虎杖茎中虎杖苷CO2超临界萃取的主要因素为DCBA（A为萃取压力，B为萃取温度，C为萃取时间，D为携带剂甲醇的添加量），其最佳组合是D1C3B2A2。结论:超临界CO2萃取虎杖茎中虎杖苷的最佳参数为：萃取温度30，萃取剂甲醇的添加量为50mL，萃取时间是60min，萃取压力是12Mpa。关键词: 虎杖；虎杖苷；超临界CO2萃取；
3、高效液相色谱Determination of Polydatin in Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc stem by High Performance Liquid Chromatography AbstractObjective：Research supercritical CO2 extraction pressure, temperature, time and presoaker methanol effect on polydatin extraction from Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc stem,
4、and discusses the best polydatin extraction parameter from Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc stem. Methods: The experiment, using supercritical CO2 extraction of polydatin from Polygonum stem, and with HPLC and UV spectrophotometric analysis of the extract. Result: Orthogonal experiment results show
5、 that the influence of Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc stem polydatin supercritical fluid CO2 extraction the main factors of D C B A (A for extracting pressure B,for extracting temperature,C for extraction time,D for presoaker methanol), the best parameter combination is D1C3B2A2.Conclusion:The op
6、timum supercritical CO2 extraction conditions were extraction temperature 30, presoaker methanol 50mL,extraction time 60min, pressure 12Mpa.Key words：Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc；Polydatin；Supercritical CO2 extraction；HPLC前 言 虎杖(Polygonumcuspidatum Sieb et Zucc.)是蓼科蓼属多年生灌木状草本植物，虎杖的干燥茎和根，性苦寒，归肝、
7、肺、胆经，具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀之效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、关节痹痛、经闭经痛，其根茎富含虎杖苷、大黄素、白藜芦醇等多种活性成分。药理学研究表明，其主要活性成分虎杖苷具有较强的生物活性。研究表明,虎杖苷能抑制心肌细胞收缩性、抑制血小板聚集、降血脂、抗脂质过氧化、抗休克等作用, 此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤 1,2。 虎杖苷对心肌细胞的作用,金春华等 3报道,通过PD对大鼠心肌细胞的研究表明, 其强心作用可能是通过增加单个细胞中的游离钙离子浓度而直接增强心肌收缩性；PD的这种效应, 使其在理论上具有比洋地黄类强心苷更优越的强心功能, 它不但使
8、心肌收缩更有力, 而且使心肌舒张更彻底, 从而大大的提高心肌工作效率。 虎杖苷具有降低全血粘度，王瑜等 4采用大鼠急性血瘀模型, 以全血高切变率及低切变率粘度值、红细胞压积值、血小板粘附率、纤维蛋白原含量、血浆粘度为观察指标, 探讨了虎杖苷降低急性血瘀模型大鼠血液粘度的作用。结果显示虎杖苷可以显著降低模型大鼠的纤维蛋白原含量和血小板粘附率, 其药效对血浆粘度降低所致全血粘度降低比其它原因所致更显著, 它主要通过降低血浆粘度来降低全血粘度从而显著改善大鼠血液循环。 虎杖苷对血管平滑肌细胞(VSMC)的作用，PD对细胞内钙、pH有双向调节作用。正常情况下PD既促进VSMC外钙离子进人细胞内,又能诱
9、导细胞内钙释放, 增加细胞内游离钙;同时升高pH以提高血管张力。休克时降低细胞内钙浓度及降低细胞内pH以降低血管张力, 使血管扩张; 能通过促进细胞外钠离子内流使用细胞去极化来调节血管, 其作用可能与钠、钾通道开放有关, 并受肾上腺素能受体、H2受体系统及鸟苷酸环化酶系统的反向调节 5。 虎杖苷用于防治脑缺血，采用改良的线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型( MCAO)研究白藜芦醇苷对大鼠局灶性脑缺血的保护机制, 结果发现PD能减轻脂质过氧化反应, 降低缺血脑组中丙二醛( MDA)含量、提高体内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化(GSH-PX)及过氧化氢酶( CAT)活性, 抑制或减轻脑水肿
10、形成, 保护细胞膜功能, 减轻缺血神经元功能损害, 对局灶性脑缺血损伤具有明显的保护作用, 这表明PD对大鼠局灶性脑缺血有明显的保护作用,其机制可能是通过有效的拮抗自由基损伤, 提高脑组织抗氧化能力来实现的 6。另外, 陈文斗等7,8观察了白藜芦醇苷注射液对大鼠全脑缺血再灌注损伤脑保护作用的剂量依赖性关系, 白藜芦醇苷注射液7.5、15、30 mg/kg组均舌下静脉给药, 结果显示白藜芦醇苷注射液各剂量组大鼠大脑右半球含水量明显低于模型组, 并均能明显升高脑组织中SOD活性, 降低MDA含量, 减少乳酸的聚积, 抑制单胺氧化酶活性, 且呈剂量依赖趋势。表明白藜芦醇苷注射液能显著减轻脑缺血再灌注
11、损伤引起的氧自由基损害, 减少过氧化脂质的形成, 并且可以减轻脑水肿,从而改善脑组织微循环及缺血、缺氧。王月刚等 9研究表明PD可以降低缺血缺氧损伤后升高的血管平滑肌细胞(VSMC)胞浆蛋白激酶(PKC)活性, 并促进PKC 的正常转位, 使病理性PKC异常改变恢复到接近正常, 这可能是PD防治脑缺血的分子机制之一。 虎杖苷具有抗血小板聚集和改善微循环作用，单春文等10研究发现PD在体内外都有抑制花生四烯酸(AA)、二磷酸腺着(ADP)和肾上腺素(AD)诱导的兔血小板聚集作用; 其抑制强度随着PD 浓度的降低而减弱,存在量效关系, 这对防治血栓栓塞性疾病有一定的应用价值。另外注射PD, 可使烧
12、伤大鼠的心输出量恢复至烧伤前的91%, 心室功能达10%, 全身外周阻力恢复到接近正常, 大鼠成活率明显提高。主要原因是PD静脉注射能促进微循环中出现动脉血流, 减轻烧伤后微血栓形成, 改善微循环11。 虎杖苷具有收缩心肌细胞作用，用内毒素(LPS)刺激心肌细胞使细胞搏动减弱, 收缩频率变小, 甚至停跳, 表明LPS可在细胞水平直接引起心肌细胞的收缩力减弱。当LPS损伤的心肌细胞给予虎杖苷处理后发现, PD不仅可以使肾上腺素能受体(-A R)功能恢复数目Bmax以及与配体的亲和力Kd都恢复至接近正常), 而且荧光抗体标记的1-AR结果显示, PD 能使减少的-AR整体数目上升。这两方面的实验结
13、果充分说明,PD 调节心肌细胞收缩性的作用是与影响-AR通路密切相关的 12,13。 虎杖苷有保护肝脏, 抑制类脂质过氧化物在肝脏堆积的作用。黄兆胜等 14研究PD对CCl4损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用, 发现它能有效地保护损伤的肝细胞, 在1 x l0 -7-1 x l0-4m m ol/L浓度范围内使细胞存活率显著提高, lx10-5m mol/L使肝细胞存活率达88.7%, 接近于正常培养肝细胞水平 15。 虎杖的临床应用有清热活血、利胆退黄之功,常用于胆囊炎、胆石症、急性肝炎、妊娠期胆汁郁积症、高脂血症、脂肪肝等疾患，尤其适用于湿热瘀结者。如丁显春等16,17近年研究表明，虎杖中的
14、主要成分虎杖苷(PD)及有效成分白藜芦醇甙有很强的抑制脂质过氧化作用而保护肝细胞。 虎杖微辛，可以透邪外出；苦寒则能清热利湿，但不甚苦,而不致败胃伤中；既入气分,又可入血分，兼有清气凉血活血之长，既能利小便，又可以通腑，具疏通之性,导湿热痰火下趋。如此，则对外邪与痰、热、瘀,皆可绾照，一药而兼数长，皆深合肺炎病理者也。在既往文献中,有单用虎杖干品500g，加水5000ml煎至1000ml，1日3次，每次100ml，用后体温在24h内退至正常，胸透肺部炎症亦吸收，疗程平均9 d的报道。现代药理研究，虎杖对多种细菌、病毒以及钩端螺旋体都有抑制作用，此外还有镇咳、平喘、化痰、缓泻通便、利尿的作用。
15、肖厚安等18应用虎杖烫伤液治疗2200例烧伤患者，效果满意。根据临床疗效观察虎杖烫伤液对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌抑菌作用较强。其中虎杖有效成份为黄酮类及综合型鞣质，具活血化瘀，止痛，收敛的功效。此药对中、小面积烧伤有明显的止痛消炎、收敛、防腐,促进上皮生长,减少烧伤后疤痕增生的特点,为治疗中小面积烧伤的理想外用药物。另刘长广等19采用虎杖内服外洗的方法治疗四肢骨折病人,也取得了显著的效果，虎杖为活血药物,能活血祛瘀以通经,又有通络定痛之功。应用虎杖外洗内服，能减轻断端疼痛,改善局部血液循环。配合功能锻炼，大大缩短了骨折的愈合时间，减少或避免骨折迟缓愈合、不愈合及关节强直等并发症,且药源广，价廉方便，不良反应小，很值得推广。 临床研究表明，虎杖治疗急性
