《乳酸菌的耐药检测方案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乳酸菌的耐药检测方案（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、试验方案：一、样品的取样在青岛胶州市的正规超市购买5种酸奶，进行实验时均处于产品保质期内。对这 几种样品分别进行取样。二、样品的稀释在无菌工作台上用灭菌过的移液管直接从酸奶样品中吸取1mL装入9ml无菌生理 盐水试管中，快速震荡试管，使其呈1:10的均匀稀释液，同法继续稀释成10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6稀释度，选取合适的三个稀释度（如：10-1、10-2、10-3）按此操 作依次制备成 A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3 的样品稀释 液。三、样品的分离鉴定1、分别用移液枪吸取A-E的样品稀释液250mL置于MRS固体培
2、养基（MRS培养基 成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠 5g，葡萄糖 20g，吐温 80 1mL，MgSO4 - 7H2O 0.58g，MnSO4 - 4H2O 0.25g，（琼脂 1520g），蒸馏水1000mL）平板上，涂布均匀后置于37C培养箱培养24h，观察 培养结果及细菌的生长情况。用接种环在各平板上挑取出现不同菌落形态大小的单一 黄色菌落，分别在平板上划线，37C倒置培养24h。2、根据菌落的大小、颜色、光泽和透明程度等，从培养24h的每个平板中选取单菌 落，在MRS固体平板上反复划线纯化，反复进行此操作步骤以使最终培养出的每个
3、菌 落都为单一菌种菌落，37C培养24h。然后依次进行菌体形态观察、过氧化氢酶试 验、淀粉水解试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验、产气试验、碳水化合物发酵 试验、乳酸定性检测。（1）菌体形态的观察将划线平板上培养了 24h的各菌株在载玻片上涂片及固定后，进行革兰氏染 色。先用草酸铵结晶紫初染色，1分钟后水洗载玻片，然后碘液媒染1分钟，水洗、 吸干。95%乙醇脱色直到滴加的酒精不出现紫色，接着水洗、吸干。最后用0.5%的番 红染色液再染色10-30秒，水洗，干燥，置于光学显微镜下观察其形态特点及染色结 果。选取油镜观察细胞呈杆状或球状，革兰氏阳性菌。（2）过氧化氢酶测定实验取一环接种的培养物，
4、涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加过氧化氢，有气泡则为阳性反应，无气泡为阴性反应。（3）淀粉水解试验将固体淀粉培养基融化后冷却至50C左右，无菌操作制成5个平板，将划线平 板上培养了 24h的各菌株分别在不同平板上划线接种。将平板倒置37C恒温箱中培 养24h。观察各种菌的生长状况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻 轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈大小可初步判 断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生细胞外淀粉酶活力的高低。需要的试剂：H2SO4、HCl、MRS固体培养基（蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g， K2HPO4
5、2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO47H2O 0.58g，MnSO44H2O 0.25g，（琼脂 1520g），蒸馏水 1000mL） 卢 戈氏碘液（碘5g碘化钾10g蒸馏水加至100ml） 需要的仪器：恒温箱（4）明胶液化试验将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22C培养7d，逐日观察结果。若用35C孵 育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4C冰箱内30min，再看结 果。结果：培养基呈液化状态为阳性。需要的试剂：明胶培养基（NaCl5g，蛋白月东10g，牛肉膏3g，明胶120g，蒸馏 水1000mL在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后
6、调pH 7.27.4，121C 灭菌 30min。）需要的仪器：电磁炉恒温箱（5）乙酰甲基甲醇试验用接种针将划线平板上培养了 24h的各菌株分别穿刺接入5支葡萄糖蛋白东水培 养基中，置37C培养58h。在试管培养液中直接加入1020滴的40%KOH和5%a -萘 酚乙醇溶液，用力振荡。结果：如果出现红色，则为阳性；若仍呈黄色，则为阴性。需要的试剂：蛋白东水培养基（氯化钠0. 5克，蛋白东1克，水加至100ml） 40%KOH 5%a -萘酚乙醇溶液）需要的仪器：电磁炉 恒温箱（6）产气试验用记号笔在各支试管外壁上分别标明发酵培养基的名称，取乳糖发酵培养基6支，分别接入划线平板上培养了 24h的
7、各菌株，第六支不接种，作为对照。接种后， 轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。将接种过的6支试管均置于37C培养基中培养2448h。观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。结果：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性。表明该 菌不能利用该种糖，记录用“一”表示：如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该 菌能分解该种糖产酸，记录用“ +”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反 应，表明该菌能产酸并产气，记录用（+）表示：如杜氏小管内没有气泡为阴性反 应，记录用（一）表示。需要的试剂：乳糖发酵培养基（其中含有哪些成分，需要用到的试剂？）需要的仪器：杜氏小管恒温箱（7）
8、碳水化合物发酵试验用记号笔在各支试管外壁上分别标明发酵培养基的名称，取葡萄糖发酵培养基6 支，分别接入划线平板上培养了 24h的各菌株，第六支不接种，作为对照。接种后， 轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。将接种过的6支试管均置于37C培养基中培养2448h。观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。结果：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性表明该菌 不能利用该种糖，记录用“一”表示：如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该均 能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应， 表明该菌能产酸并产气，记录用（+）表示：如杜氏小管内没有气泡为阴
9、性反应，记 录用（一）表示。需要的试剂：葡萄糖发酵培养基（其中含有哪些成分，需要用到的试剂？）需要的仪器：杜氏小管 恒温箱（8）乳酸定性检测部分用10%的硫酸1毫升，2%的高锰酸钾1毫升在10毫升发酵液中先将乳酸转化成 乙醛，再以硝酸银溶液浸湿滤纸搭于试管口，加热试管中的发酵液，如果发酵液中有 乳酸，与硫酸和高锰酸钾反应生成的乙醛在加热时就会挥发，在管口处遇硝酸银就会 使试纸变黑。三、乳酸菌的药敏性实验利用纸片扩散法对分离自市售泡菜的乳酸菌进行10种左右抗生素包括卡那霉 素、链霉素、庆大霉素、万古霉素、环丙沙星、氨苄西林、青霉素、四环素、氯霉 素、头孢唑林等的药敏试验。具体操作方法：将鉴定出的
10、乳酸菌分别在MRS液体培养基培养24h后，用生理盐水校正菌液浓度 至与0.5麦氏比浊管相同。用移液器吸取稀释好的菌液1ml，注入已灭菌的培养平皿 中央位置，然后倾注15ml 40-5OC左右的或MRS固体培养基，充分摇匀。待培养基 凝固后贴上药敏纸片，用无菌镊子压一下纸片使其与培养某表面贴牢。每个100mm平 板贴3-4张，纸片与其中心距离不得少于30mm，纸片中心与平皿壁间距不得少于 15mm，标记抗生素名称。经37C培养后，用卡尺从平皿背面测量抑菌圈直径，记录 结果。抑菌环内有任何生长都判断为耐药。附：麦氏比浊管配制方法：麦氏比浊管是McFarland发明的一种用于微生物比浊 的不同浊度的
11、标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表 可查的.这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值.做药物敏感实验采 用MIC法，所需细菌浓度要稀释成0.5麦氏管，其菌液浓度为1.5x108个/ml。配法举例：麦氏浊度标准(0.5号)(1) 将 0.5mL 0.048mol/L 的 BaCL2 (1.175%w/v BaCL2 - 2H2O)加到 99.5mL 0.18mol/L (0.36N)的H2SO4(1%v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。(2) 按每管4-6mL将硫酸钡悬液分装于带悬盖的管子中，管子尺寸应与培养或 稀释接种菌所用的管子一致。(3) 这些管子应密封并贮存于室温避光处。(4) 每次使用前，应将浊度标准管置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊 度应均匀一致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。(5) 使用前核实其正确浓度，每个月都应证实或更换。浊度标准的正确浓度应 使用分光光度计测定吸光度核实。该分光光度计光径为1cm，并配有合适的比色杯。 0.5号麦氏标准管在625nm处的吸光度值应为0.08-0.10。四、耐药性的判断在37C培养16-18小时后，各平扳形成了清晰地抑菌圈，测量其直径，记录数 据，然后判断乳酸菌的耐药性。
