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1、银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。大致的原理是银离子在碱性pH环 境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上 低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。 这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的 检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗 粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸 残基的蛋白质有时
2、候呈负染。试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、 甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间100ml乙醇（40%乙醇）25ml冰醋酸（10%冰醋酸）加水到250ml致敏：30min 75ml乙醇（30%乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水 到终体积250ml水洗：3 x 10min银染：20min 0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml水洗：2 x 1 min （注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色）显色：视情况而定6.25 g Na2CO3、5
3、0 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml 终止：10min 3.65g EDTA.Na2.2H2O或者1g甘氨酸 加水到终体积250ml保存：1%冰醋酸，4 C注意事项：1. 固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。2. 甲醛在使用前加入。3. 最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。4. 显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。5. 银染液和显色液需要预冷。6. 所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！7. 清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。银染注意事项：1. 银染主要出现在胶的表面，
4、用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因 此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马 斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染 测定不同蛋白的比例。4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1以S 的去离子水。7. 如果染色后
5、有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干 扰性物质。10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗 可以改进染色效果。12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用 量即可避免。13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色
6、提高40倍。14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。六我发个简单的配方，我一直用还挺好用，固定甲醇250ml、冰醋酸25ml、加双蒸水至500ml ,30min,水洗2x2min，后水洗1h。敏化硫代硫酸钠0.1g加双蒸水至500ml,冲洗双蒸水2x30s银反应 硝酸银0.5g加双蒸水至500ml，避光孵育30min，冲洗双蒸水2次x5min显色 碳酸钠10g加双蒸水至500ml，甲醛500ul，现用现加。终止观察至想要效果，1%的冰醋酸终止，七银染应该注意的事项：1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶(0
7、.5-0.75mm)可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因 此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马 斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不 同蛋白的比例。4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1以S 的去离子水。7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状
8、灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过 程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。不要用双蒸水用去离子的，双蒸水的某些离子会和agno3反应若用去离子水，也要经常给机器换滤头，以免去离子不净一步骤溶液时间固定甲醇100ml冰醋酸25ml加双蒸水至250ml30min冲洗双蒸水3次敏化甲醇75m戊二醛（25%w/v）1.25ml硫代硫酸钠(5%w/v)10ml醋酸钠(17g)30min加双蒸水至250ml冲洗双蒸水3次银反应硝酸银溶液（2.5%w/v）25ml（甲7%w/v）醛0.1ml加双蒸水至250ml20min冲洗双蒸水2次显色碳酸
9、钠（6.25g）（甲7%w/v）醛0.05ml加双蒸水至 250ml2-5min终止EDTA-Na22H2O（3.65g）加双蒸水至250ml10min冲洗双蒸水3次二1） PAGE胶切下后用50%乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟2）2%硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒3）2%硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒4）6%碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗5）加中止液10%乙酸中止即可三 1.固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次=20 分钟
10、；2. 50%EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；3. 预处理：0.02% Na2S2O3处理一分钟；4. 水洗：ddH2。漂洗三次，每次20秒；5. 染色：0.8ml 20%AgNO3+72ml 0.04%HCHO 处理 PAGE胶 20 分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12%Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02% Na2S2O3,漂洗 10-15 分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50%MeOH, 12%H Ac,10 分钟。四1 银染液1 （1000ml）:甲醇50%乙酸12% （甲醇500ml冰醋酸120ml）2 银染液2 （1000ml
11、）：甲醇30%，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1-2ml） 甲醇300ml乙酸钠54.4g戊二醛10ml硫代硫酸钠1g乙酸1-2ml3显色液（1000ml）无水碳酸钠2.5%甲醛0.02% （无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml）4硝酸银（100ml）： 20%硝酸银（过滤后待用）染色步骤：1银染液1洗2次，每次5分钟2银染液2洗1次，每次30分钟3超纯水洗2次，每次1分钟4 0.5%硝酸银 洗30分钟5超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色6看到各条带，则倾去显色液,1%乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。但水洗 不充分又可能导致背景较深。我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水浸泡液：30%乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛 0.625ml，0.2% NaS2O35H2O银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛终止液：1.46% EDTA-2Na2H2O
