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1、细胞传代培养 一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，
2、则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株2、 试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入12ml 0.25胰酶
3、溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xPBS+纯水溶解到1L，滤器过滤除菌，4保存，用前可在37下回温。10x PBS配方：Na2HPO4(14.2g) KH2PO4(2.32g) NaCl(80g) KC
4、l(2.02g) (调 至PH=7.4）五、实验结果 传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2天左右就在瓶内形成单层，达到七八成满。这时需再次传代 六、 讨论与反思无菌操作中的注意事项 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75乙醇消毒。操作前2030分钟起动超净台灭菌。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。 每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 多做，熟能生巧
