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1、卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。卡拉胶是由，1，3-D-吡喃半乳糖和1，4-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。与琼胶相比，卡拉胶所有的-连接和（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。对卡拉胶来说，它的结构在（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图1卡拉胶可分为八种类型。-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶，-卡拉胶。另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重
2、复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为-族卡拉胶、-族卡拉胶、-族卡拉胶。卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶2。而卡拉胶酶主要有-卡拉胶酶，-卡拉胶酶，-卡拉胶酶等，其主要是依据所降解的底物命名的。许多海洋微生物如Pseudoalteromonas c
3、arrageenovora,Pseudomonas carrageenovora3,4等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）体内也有5。根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。1995年，Philippe Potin等人38报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 Da，远远大于经SDS-PAGE测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kDa。cgkA基因所编码的-卡拉胶降解酶序列与GH16家族中其他成员的序列具有较高的相似度，GH16家族水解酶的催化
4、区域多序列分布表明-卡拉胶降解酶的Glu163残基在催化过程中起主要作用。免疫印迹实验表明天然和重组的细菌胞内提取物都存在一个分子量为442 kDa的蛋白质分子，结果表明-卡拉胶降解酶是以前体蛋白形式产生并在分泌过程中经历了两次蛋白水解切割作用，即先切去信号肽，然后再切去C末端的区域从302位点到397位点的96个氨基酸。成熟的-卡拉胶降解酶由275个氨基酸组成。为了评定其作用的分子机制，通过使用凝胶过滤色谱和13C-NMR技术分析-卡拉胶降解酶水解新卡拉六醇的产物，结果显示，最先形成的是新卡拉二醇和-新卡拉四糖，说明该酶作用的分子机制为保持异构体构型。2001年，Gurvan Michel等
5、人6在研究P. carrageenovora所产-卡拉胶降解酶的活性部位时，首次提出隧道模型，并认为酶的隧道状活性部位与多糖的降解有关。其中谷氨酸残基E163，E168分别起到亲核催化作用和酸碱催化作用，天冬氨酸残基D165在催化循环中起促进最终转变状态解体作用。2003年，Gurvan Michel等人7在研究-卡拉胶的降解机制中通过使用Alteromonas fortis 产的-卡拉胶降解酶与-卡拉胶相互作用，结果发现碱性蛋白残基和多糖链的硫酸基之间的相互静电作用在识别-卡拉胶的过程中起主导作用。C末端的A结构域在天然酶中具有高度的灵活性，采用a/的折叠形式。在底物与酶的复合体中，多聚阴离
6、子模块向螺旋的凹槽移动，形成一个隧道。在降解过程中酶从开放的形式转变成闭合的形式。-卡拉胶降解酶的催化腔仅能容纳一条-卡拉胶链，因此酶蛋白必须先把-卡拉胶双螺旋从-卡拉胶纤维结构中分离出来，然后再水解其中单一的-卡拉胶链。多聚阴离子的-卡拉胶链与卡拉胶降解酶的多聚阳离子的非催化表面相互作用，很可能取代了双螺旋之间的钙离子。非催化的外表面被看做一个楔子，可使双螺旋链与卡拉胶纤维分开，但其机理还未有明确的解释。-卡拉胶降解酶的隧道型活性部位在打开-卡拉胶双螺旋和阻止已分离的-卡拉胶链重新结合到晶体上的过程中起到重要的作用。2007年，Guibet等人8对P.carrageenovora所产的-卡拉
7、胶降解酶进行了纯化、克隆和测序，序列分析结果表明，这一分子量为105 kDa的酶蛋白分子具有特征性的区域，为一连接物连接至少两个相对独立的单元，N末端区域可能折叠成为-螺旋桨结构。通过1H-NMR和LC-MALLS技术检测-卡拉胶的酶解过程表明-卡拉胶酶为内切酶，并通过异构体构型完全转换的分子机制来酶解-卡拉胶。Potin P等1991年报道从红叶藻属(Delesseria sanguinea)分离了一株能够降解不同硫酸化半乳糖聚合物(琼胶或卡拉胶)的细菌，用硫酸铵，凝胶过滤色谱(Sephacryl S 200 HR)，离子色谱(DEAE-Sepharose-CL6B)纯化-卡拉胶酶，用SDS
8、/PAGE电泳检测为单一蛋白质，测定酶分子量为40.000，最适pH7.2，300稳定，但在40只维持lh。Sarwar G等1987年报道用2216E培养基添加商业0.1%卡拉胶培养噬纤维菌属的细菌Cytophaga sp.lk-C783，分离胞外卡拉胶酶。用硫酸铵沉淀，离子交换色谱，凝胶过滤色谱(G-200)纯化得到-卡拉胞酶，纯化的酶分子量用SDS/PAGE电泳测定为100000，-卡拉胶酶的最适pH为7.6，最适温度为25。金属离子对场Cytophaga sp.lk-C783生长的影响，NaCl和MgCl2可被细菌利用，2216E中培养基最小浓度为0.05mol/L NaCl，0.25
9、 MgCl2。KCl和CaCl2对产酶没有作用，当营养物质充足的时候，卡拉胶酶在休眠和生长的细胞都可以合成和释放。卡拉胶的降解方法可归纳为三类酸水解法、超声波降解法和酶解法。研究卡拉胶的热水或冷水提取物的化学结构，多用酸水解、甲基化、甲醇分解等方法处理。目前，普遍采用的方法是酸水解法。从生物角度来讲，卡拉胶是某些红藻的细胞壁多糖，通常附着在海藻表面的海洋微生物，会利用自身分泌的卡拉胶酶来降解卡拉胶，有效的利用藻类中的物质来获得能量。目前，卡拉胶酶被用作海藻解壁酶，以获得DNA，单细胞，蛋白质和原生质体。并且在卡拉胶粘度很大，提取非常困难的时候，添加卡拉胶酶以后可以使卡拉胶很快降解，粘度下降，大
10、大方便了的提取。在卡拉胶的药理活性实验中，未降解的卡拉胶由于粘度大、扩散困难、很难吸收，且其毒性大，未达到有效量就能致死实验动物。为了克服这个困难，就需要使用卡拉胶酶降解卡拉胶，使其既保持药理活性又易吸收，减小毒性。而且降解的卡拉胶是一种有效的体内致炎剂，已有几种酸降解的卡拉胶制剂被应用于临床上。降解的卡拉胶像肝素一样与血纤维蛋白原形成可溶络合物且毒性小，因此对卡拉胶酶的研究成为了迫切的需要。由于-卡拉胶低聚糖可诱导植物胚胎发育过程中小孢子的形成，效果较热休克方法高两倍，有望成为植物培养中从小饱子获得双单倍体的新型的促进剂，所以在-卡拉胶低聚糖的制备中，卡拉胶酶必将扮演重要的角色。到目前为止，
11、虽然以低分子量形式出现的卡拉寡糖以其独特的活性成为近年来的研究热点，并且酶法水解卡拉胶与光谱和化学方法相比，它是一种简单、灵敏测定卡拉胶结构的方法，但卡拉胶酶的相关研究及应用还有待于进一步的发展，所以卡拉胶酶的应用还不是很广泛9。2 材料2.1 菌种Cellulophaga lytica strain:N5-22.2 试剂-卡拉胶：购自郑州世纪安华食品商贸有限公司；海水（大连开发区丽娇湾）PAGE（Polyacrylamide Gel Electro-phoresis）电泳试剂：分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 8.8电极缓冲液： 3.0 g Tris 和14.4
12、g 甘氨酸溶于H2O中，定容于1L，终pH为8.3DNS试剂：将6.3 g 3，5-二硝基水杨酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）和2 mol/L NaOH加到500 mL含185 g酒石酸钾钠的热水中，搅拌溶解后再加入5 g结晶酚和5 g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮存在棕色瓶中放置一周后使用。pH 7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液：0.2 mol/L Na2HPO4 16.47 mL与0.1 mol/L柠檬酸3.53 mL充分混合，终pH为7.0。3 仪器DNP-9162 电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；SHZ-D（
13、）循环水真空泵 巩义市予华仪器有限公司；BS223S电子天平 塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；PHS-2C精密级数字式酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司；MLS-3750高压灭菌机 日本SANYO 公司；HDL1360-W 洁净工作台 北京东联哈尔仪器有限公司；HZQ-C 空气浴震荡器 哈尔滨市仪器制造有限公司；TDL-5000B低速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；SHZ-82S水浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司；LG16-W台式高速离心机 北京京立离心机有限公司；UV-2000分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；透析袋（截留
14、分子量8000到14000） USA；DYY-4C型电泳仪 北京六一仪器厂；BCD-205TACS冷藏冷冻箱 青岛海尔股份有限公司；4 方法4.1 培养基的制备4.1.1 种子液培养基-卡拉胶 0.1%，蛋白胨 0.5%，酵母提取物 0.1%，FeSO47H2O 0.002%，陈海水，pH自然4.1.2 固体平板培养基-卡拉胶 1%，蛋白胨 0.5%，NaCl 2%，无机盐母液110ml，蒸馏水 890ml，琼脂 1%，pH7.24.2 粗酶液的制备将菌株Cellulophaga lytica strain:N5-2接到斜面培养基上活化72h后，再接种到装有50mL发酵培养基的250mL的三角
15、瓶中，150rpm振荡培养20h后，再按4%的接种量接入装有100mL发酵培养基的250 mL的三角瓶中，35，150r/min振荡培养20h，得到发酵液在4条件下，5000r/min离心30min，得上清液为粗酶液。（除非特殊之处，所有纯化步骤均在4条件下进行，以免酶失活）4.3 (NH4)2SO4进行盐析沉淀及-卡拉胶酶粗酶的制备向粗酶液中逐渐加入(NH4)2SO4至40%饱和度，4静置沉淀过夜后，5000r/min冷冻离心去除杂蛋白后，再向上清液中逐渐加入(NH4)2SO4至80%饱和度，4静置过夜后，5000r/min冷冻离心收集沉淀并用少量冷却的蒸馏水溶解，置透析袋（MWCO：8000-14000 Da）中用蒸馏水4透析脱盐，再经冷冻干燥即得粉状的-卡拉胶酶粗品，-20保存。4.4 电泳与酶谱实验将所得
