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1、青岛大学硕士学位论文应用SD-TOF-MS技术筛选早期胃癌血清生物标志物研究姓名：李春伟申请学位级别：硕士专业:普通外科指导教师：张佃良 / 应用SELDI-TOFMS技术筛选早期胃癌血清分子标志物研究摘要目的：应用表面加强解吸电离一飞行时间质谱（surfaceerthancodasr deoptioninzaton time。o-ight mas pectromry,SELDI。TOMS）技术对胃癌患者血清蛋白指纹图谱进行分析,筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，寻找更可靠的评价标准用于早期胃癌诊断和临床分型以指导个体化治疗，旨在进一步提高对 肿瘤分期和预后的判断，以更好地监测治疗效果。方法:
2、表面加强解吸电离一飞行时间质谱技术及其配套蛋白质芯片检测19例胃癌患者和例健康人的血清蛋白质组图谱，运用omarkerWizr TM和 BarkePttrnsTM软件分析处理数据筛选具有明确临床价值的分子标记物或其 组合，以进行早期分子诊断并建立胃癌诊断分类树模型。 结果：胃癌组血清与正常人血清蛋白质谱共有34蛋白表达存在统计学差异 （O05),其中2873 m/z,33m/z，4526 mz,62 m/，6121 和778 /z 蛋白质峰组成诊断模型I，可将胃癌与正常人正确分组，灵敏度、特异性分别为 949%、57;另外,873 /z，61 z和778/z蛋白质峰组成诊断模型 II,可将早期
3、胃癌与ii/iiiv期胃癌，其敏感性和特异性分别为8936（424)、 922%（11/2).结论：利用SLDI-0FMS技术在人血清中可以筛选到早期胃癌快速诊断的特异 性标志物，建立早期胃癌诊断的蛋白质模型；该方法在胃癌诊断尤其早期胃癌诊断 方面具有重要的价值，值得进一步研究.硕士研究生：李春伟普通外科 指导教师：张佃良教授主任医师关键词:胃癌分子标志物表面加强解吸电离一飞行时间质谱蛋白 质组模式 “0 mn”3哺删眦4、呱Analysis of sru oakrs screenig or diagnoss of sae I gastriccancerusingSEDIOFSAstractO
4、betive：o makea prteom nalyss usingsurace-enhnced laser esoptin/ionizatin tieo=fghtmss pectroety(ELDI-OFMS）n he seum of sag astricancer patients an esablish early diagnosic modelfor identiing stae Igastic cancr pliminarily。ethod:Serum sampesfrom1 69 sc cace aints and 83ae nd endrmachd heathy indviual
5、s wre anayzed ySELDTOF- roi Cpary technology.e esultigSELDITO-MS spetralatere aalyzedusinth imer zard TM adBiomarkPattrnsTMoftware tfmd differentiprote and evlop aclassifcation teer gsiccrlr。Rests：A totl of 34 maeakwere ideiied。Six peak at mass:chrge ratios（nV)o73，316，526，5762,6121 and 778were used
6、to onstrct the dagostic modl Ihe moelI ud effectivel distinguish gatric ancelsamplsm ntrolsmples，achiving snstvty and secii够of 93.49%ad 917%，resectieyI aditn， we idenified re the six rotein paksat 2873,612nd 778/z,whch culd otrt dianotc modeIThemodl IIcould isiguish betwe stage I asric aner ndstaII/
7、IIIN astiCllCeT wm l ccrcy of 12.Coclusi：Dagnostc moes ofserums poeis etects b SLDITOS rot hip arry tehnology coretly dtinies garic CanCgfrom contros，ad has ignificne for ceeng stag I gastric anceT fom tge I/gatic cancer.SE IF-S i a useulto for th dectinand ntiatn f new roton markerKeyord:gstic canc
8、er bimakrs SELD-TOFMSerum otomc terns引言引言胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一,在世界范围内为第四多发恶性肿瘤和第二致死性肿瘤，值得注意的是几乎近三分之二的胃癌发生在经济欠发达的地区或国家, 包括中国喇.近年来,虽然随着上消化道造影、内镜活检、术前新辅助治疗、术后 综合治疗等诊疗水平的提高，胃癌五年生存率有所提高,但效果仍欠理想。据报道，早期胃癌(I期胃癌）五年生存率可达82。9%、II期胃癌628、II期胃癌7。8、 IV期胃癌33，总体五年生存率20左右口嘲。一般认为影响胃癌预后的主要因素是肿瘤的分期，分期越早,预后越好;早期诊断胃癌是最有效降低死亡率、提
9、高治愈 率的方法.因此，有必要对早期胃癌诊断的方法进行探索和研究。目前,内镜活检、手术切除肿瘤进行病理学检查被认为是胃癌诊断的金标准， 但这种技术具有诸多弊端，其缺点如耗费时间长、费用贵、给病人带来诸多不适, 更重要的是,很多病人得到明确诊断后,即发展成进展期胃癌甚至晚期胃癌，治疗 效果较差：此外,内窥镜活检送病理或手术切除后送病理无法制定人口众多的筛查方案睁。因此，有必要探索研究创伤小、费用低、便于筛查，具有高度特异性和灵 敏度的肿瘤标志物进行早期胃癌的诊断。自进入0世纪0年代以来，人们已经开始在胃癌患者外周静脉血中寻找与胃癌相关的生物标志物，以期能够对早期胃癌进行尽早诊断.目前发现与胃癌相
10、关的肿瘤标志物主要有癌胚抗原（CA)和糖链抗原99（CA9）、2(A5）、42（CA24）、 5（CA50)等睁103。但这些指标敏感性、特异性均较低,尚不足于用来进行早期胃癌的 诊断。最近大量研究表明，单个肿瘤标志物尚不足用于早期肿瘤的诊断，有不少学者利用多个肿瘤标志物组成一个蛋白质组诊断模型进行全身多个系统肿瘤的诊断，比如肝癌1刳、卵巢癌nH、乳腺癌n蝴1、肺癌乜删、前列腺癌嘲训、膀胱癌D2刊、胰 腺癌1、食管癌明大肠癌1等疾病的差异蛋白质组学研究中发现多种疾病相关的候选蛋白标志物。关于胃癌肿瘤标志物的研究也有所报道，只是目前所报道胃癌相关 标记物临床价值具有不确定性，这一方面反映了许多研
11、究规模较小,纳入病例数偏 少，随访时间较短,统计学报告差；另外目前报道的研究大多数分析单一肿瘤标记 物的临床价值，对联合应用几种标记的组合分析不足。所以,还需要高质量的设计 科学的多中心试验以得出可靠的结论，急切需要迸一步研究.近几年，新兴的表面增强激光解吸电离一飞行时间质谱(srae enaced serdsortioniniatioim of flightmass spetrometry tenoloy， SEDTOF-MS)技术为差异蛋白质组学研究提供了一个十分理想的平台，同时也为全身多个系统肿瘤标志物的研究提供了一个理想的平台.SELDITOF-S技术是由日本 著名科学家田中耕一发明,
12、美国Cipherg Bosytems公司进行进一步研究并使之青岛大学硕士学位论文商品化.该系统由3部分组成：蛋白质芯片;芯片阅读器生物信息学。该技术的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下,解析后形成荷电离子，不同质荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同,而绘制出一张质谱图案,可以显示不同蛋 白的相对分子量等信息。（工作示意图i如下）。SELD技术能快速分析、处理大量质谱图信息，将测得质谱图与正常人或某种疾病或者疾病不同阶段的标准图谱进行对 比,就能捕获该疾病不同阶段特异性的相关分子蛋白质。蛾麟辫图1 SEDITOF船工作示意图表面加强解吸电离一飞行时间质谱（SLDITO-MS）技术不同与传统
13、的蛋白质组学技术，有以下一些优点:（1）1次可以实现上万种蛋白质检测分析,快速、简便、 易行、高通量、平行分析,； （）需样品量极少，只需25个细胞所提取的蛋白 质即可;(3）较高的信噪比； （4）可以对小分子量的蛋白质进行鉴定； （）可以 和基因芯片结果进行比较分析，在蛋白质组和基因组之间建立联系;（6)应用多个 未明确性质的蛋白质或肽信号可联合组成诊断模型，对全身各系统肿瘤的早期诊断 比单一的肿瘤标志物更准确可靠,敏感性特异度更高等。SELDTOF-MS技术克服了 诸多传统蛋白质组学研究中无法解决的问题,实现了蛋白质芯片技术临床检测应用的飞跃。高通量的质谱技术为寻找新的标志物用于早期肿瘤的
14、诊断和监测治疗效果, 已经成为一个临床医学研究的新方向。本课题设计总路线如下图2。图2本课题设计总路线资料和方法第一章资料和方法.1研究对象选取我院及青岛市立医院普外科200年5月至20年5月连续入院的原发性 胃癌病人作为研究对象。胃癌分期标准按Aerican oitCnnittcc on Cncer（7th ed, 2010).所有病人均为汉族,经病理证实为胃腺癌，入选病例排除标准如下：（）年龄大于75岁；（2）患有神经性厌食、炎性肠病、免疫性疾病和内分泌疾患；(3）感 染;(4）幽门梗阻；(5)心力衰竭（心功能大于3级）、肝衰竭（hld分级C级）、肾衰竭；()近4个周经过外科治疗、内镜支架术、放射治疗或化学治疗;(7)经受过可以严重影响新陈代谢或体质量的药物治疗。健康人血清标
