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1、Selenium protects sorghum leaves from oxidative damage under hightemperature stress by enhancing antioxidant defense system高温胁迫下硒通过增强抗氧化防御系统保护高粱叶子免受氧化损伤摘要：通常在高温胁迫条件下诱导植物氧化应激反应。在植物中硒经常充当抗氧化剂，然 而，其在高温下如何诱导氧化应激反应的作用原理还不明确。我们推测施用硒能部分减轻因 高温诱导的氧化应激反应以及减弱高温在高粱的生理、生长、产量上的负面作用。本研究的 目的是调查硒在以下几个方面的影响：a叶片光合作用，膜
2、的稳定性及抗氧化酶活性；b 高粱作物在可控高温胁迫环境下生长的作物产量及产量构成因素。作物从播种到种后63天 期间在最适温度(OT： 32/22C，白天最高/夜间最低)下生长。在种后第63天所有植株叶 面喷施硒酸钠(75 mg L-1),在种后第65天施行高温胁迫(40/30C)直至成熟。对生理生化性 状以及产量性状进行测定。高温胁迫降低叶绿素含量，叶绿素a荧光，光合速率以及抗氧化 酶活性和增加氧化产物和膜损伤。在高温胁迫下因减弱抗氧化防御导致作物产量与最适温度 相比较低。施用硒是通过加强抗氧化防御减弱膜损伤获得更高的作物产量。在高温条件下施 用硒，抗氧化酶的增加程度以及活性氧的减少程度较大于
3、在最适温度下施用硒。目前的研究 表明，在高温胁迫下硒能通过增强抗氧化防御系统来起到保护性作用。关键词：抗氧化酶；咼粱；咼温胁迫；氧化损伤；活性氧；硒引言高粱Sorghum bicolor(L.) Moench是半干旱地区的一种重要作物，但在作物发育的开 花前和开花后阶段，其生长、发育和产量都容易受到干旱和高温胁迫伤害。开花期处于高温 胁迫下的高粱的产量损失是由于一个差的结实率，种子灌浆结实期的早期比后期对高温胁迫 更为敏感。在花后发育阶段，种子产量损失主要是由于种子尺寸的减小。高温胁迫也可能导 致叶片过早衰老，这是内部程序性变性过程导致组织坏死。叶片衰老的一个典型现象是叶绿 素减少，膜损伤加大
4、和光合能力下降。然而高温胁迫直接伤害光合器官，降低光合速率和减 少同化与供应的持续时间。高温胁迫能促进叶绿体中活性氧ROS)的积累，特别是去除活 性氧的抗氧化能力低时。在高温条件下，叶绿素分子过度激发会导致活性氧的形成。在叶片 衰老期间我们注意到抗氧化酶活性普遍降低。高温胁迫下参与清除活性氧的抗氧化酶如超氧 化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POX)。硒(Se)长期以来被认为是用于动物和人类营养所必需的微量营养元素，因为它是防止 身体组织氧化损伤的硒基酶一谷胱甘肽过氧化物酶不可缺少的一部分。根据目前的想法，高 等植物并不需要硒,硒对植物是否是一种必需元素的问题仍存在争议。
5、我们先前的研究表明， 对大豆Glycine max (L.) MelTT面喷施硒可以提高抗氧化酶活性和降低膜的损伤以及ROS 含量。最近的研究表明，低浓度的硒可以保护植物免受多种类型的非生物胁迫1638。硒 能提高暴露在低温、干旱胁迫、铝毒下植物的耐受性。在Stanleya pinnata中负责硒积累的 分子机制显示，参与硫同化和抗氧化活性的基因以及茉莉酸和水杨酸途径的防御基因高度表 达。高温胁迫下，由于其抗氧化基因和防御基因的表达作用，硒能通过延缓叶片衰老以及增 加碳供应来提高作物产量。假设一个高温胁迫环境，硒能通过其抗氧化性减缓氧化应激反应。本研究的目的是调查 硒在如下几个方面的能力：a提
6、高膜的稳定性，增强抗氧化酶活性和叶片光合作用；（b）在 高温胁迫下增加高粱产量。材料和方法1种植材料和生长条件这项研究是在位于美国堪萨斯州曼哈顿的堪萨斯州州立大学农学系的可控环境设备中 实施的。高粱作物Hybrid DK-28E种在含有lOKg的特定结构的粘性土壤（PH 7, 土壤:悬浮 液1:2.5）的盆中，这些土壤来自于附近的试验农场。每千克土壤中含有0.55克速效氮，1.45 克磷和3.84克。在15L的盆中（盆顶部直径和底部直径分别为27.5和26厘米，盆深25厘 米）于4厘米深处每盆种五粒种子。露头后，间苗，每盆留三株保持到成熟。在播种时每盆 施奥绿肥（控释肥，N:P:K 14:14
7、:14%，赫梅特国际，托皮卡，堪萨斯州，美国）5g。出苗 后每一个盆均施加4g内吸杀虫剂（1%马拉硫磷，吡虫啉，赫梅特国际，托皮卡，堪萨斯州， 美国）。作物按常灌溉避免水分胁迫。作物从播种开始在温室中生长63天。除自然光照外还 可用荧光灯补充光照（16小时光照，8小时黑暗，昼/夜温度32/22）以保持温室中植物冠 层的光量子通量密度在1000 - 1400p M m-2 s-1。然后，将作物移到两个大型室内生长箱（Conviron Model CMP 3244，温尼伯，马尼托巴省，加拿大）中进行处理。处理包括两个 温度模式（最适温度（OT, 32/22 C）和高温（HT, 40/30 C）和两
8、个硒处理（有硒和 无硒）。每个处理重复十个盆。在种后第63天，每个生长箱的高粱作物用手动喷雾器（1.5-L 容量，压缩空气类型，Hummert International, Earth City, MO, USA）喷施 75 mg L-1 的硒酸钠。 每盆喷洒在植物上约150毫升硒酸钠（Na2O4Se）溶液。对照用清水喷洒植株。此后，植株保 持在试验温度条件下（OT和HT） 45天（生理成熟时）。在生长箱中，白天温度模式与夜间 温度模式保持白天最高温度和夜间最低温度之间16小时30分钟的过渡期，反之亦然。在最 适温度处理中，平均白天温度和夜间温度（土SD）分别为31.7C（0.4）和21.8C
9、（0.5）。 在高温处理中，相应的温度分别为39.7 C （0.3）和29.9 C （0.4）。光周期是16h， 光子通量密度是780p mol m-2 s-打由在植物冠层顶部的冷色荧光灯提供。在生长箱中设定 85%的相对湿度。贯穿整个试验过程，每隔20分钟一次连续检测所有生长箱中的空气温度， 相对湿度，光照水平。2叶绿素含量，叶片温度，叶绿素荧光，气体交换测定从实验开始的28天每隔七天的中午（11:00与13:00之间）测定在四个标记植株上着生 的完全展开的旗叶的所有生理指标。使用自我校正叶绿素仪（土壤植物分析设备（SPAD）, 型号 502， Spectrum Technologies,
10、Plainfield, IL, USA）测定叶绿素含量。叶片暗适应的 30 分钟后用脉冲调制荧光仪（OS 30, OptiScience, Hudson, NH, USA）评估叶绿素荧光性。光系 统II最大光化学效率（Fv / Fm比值）被确定为可变荧光值（最大荧光值与最小荧光值） 与最大荧光值比，Fo/ Fm被确定为基态荧光值与最大荧光值比，这些测量值均记录在四株 植株上。此外，叶片水平气体交换值（光合作用，气孔导度，蒸腾作用）由LICOR 6400 便携式光合作用仪（LICOR, Lincoln, NE, USA）测量。在生长温度和大气CO2条件下获得气体 交换值。在LICOR 6400的
11、内部LED光源设定为1600 p mol m-2 s-打以确保所有测量值在 恒定，均匀的光线下测定。2.1氧化产物，膜脂过氧化和膜损伤样品来自于所有处理植株（最适温度和高温下，硒处理和无硒处理）在11 : 00与13 : 00之间的顶部完全展开的叶片。组织取样后立即进行氧化产物和膜损伤的定量分析。用于 膜脂过氧化和抗氧化酶活性测定的叶片被切成小块，在液氮中-80C冷冻保存直至进一步分 析。正如Behera等所描述的通过硫代巴比妥酸与丙二醛反应物质(TBARS)测定膜脂过氧 化。冷冻叶样品(100毫克)在5毫升的0.1%三氯乙酸中磨成匀浆。匀浆在4C下10000*g 离心5分钟。0.3ml上清液
12、的等分试样与1.2ml在20%的三氯乙酸中制备的0.5%硫代巴比 妥酸混合，并在95C下反应30分钟。停止反应后，在冰浴中5分钟，样品在25C下10000*g 离心10分钟。使用一台日立U-2000双光束紫外/可见分光光度计(Hitachi, Lake Sherwood, MO, USA)在532 nm处测定吸光度。减去在600nm处的非特异性吸光度后，使用155 mmol -1 cm-1吸光系数确定丙二醛(MDA)浓度。膜脂过氧化程度用MDA含量表示(nmol g-1)。下面由Patterson描述的方法，通过检测过氧化钛配合物在410nm处的吸光度来测定过 氧化氢(H2O2)水平。1ml冷
13、丙酮上清提取液中加入0.1ml20%钛试剂(20% w/v TiCl4在12.1 MHCl)和0.2ml 17M氨水溶液。在4C3000*g下下离心该溶液10分钟，将上清液弃去。 将沉淀物溶解在3ml 1 M硫酸中。使用日立U-2000型双光束紫外/可见光分光光度计在 410nm处测定该溶液的吸光度。已知过氧化氢的浓度生成的标准曲线对吸光度值进行校准， 并用鲜重的nmol g-1表示。超氧阴离子根据Chaitanya和Naithani估算，并用鲜重的可变光密度min-1 g-1表示。 将已称重的叶片在含有二乙基二硫代氨基甲酸盐(10-3M)的冰冷的磷酸钠缓冲液(0.2 M, pH 7.2)磨成
14、匀浆。立即将匀浆在3000*g下离心1min。以减少的四唑氮蓝(2.5X10-4M)量来 测定在上清液中的超氧化阴离子量。用Hitachi U-2000型双光束紫外/可见分光光度计在540nm处测定最终产物的吸光度。 根据Sairam等测定叶片离子泄漏量。打孔叶片(0.2 g)放在两个含有20ml去离子水的试管 中。其中一个试管保持40C的恒温水浴30分钟，其电导率(C1)用电导计测定。另一试管 保持在沸水浴10分钟，记录其电导率(C2)。膜损害用以下公式计算：1-(C1/C2) X 100, 并用百分比表示。3抗氧化酶活性对于 SOD (EC 1.15.1.1), CAT (EC 1.11.
15、3.6)和 POX (EC 1.11.1.7)酶的测定：每克新鲜冰 冻组织与含有1mM乙二胺四乙酸及1mM二硫苏糖醇的pH 7.8的0.1M Tris-HCl缓冲液和 5ml聚乙烯吡咯烷酮研磨成匀浆。在4C下，将匀浆在20000*g下离心。取上清液用于测量 酶活性。SOD酶活性是由在560 nm处四唑氮蓝光还原测量法决定的。一个酶活单位相当于 四唑氮蓝的光还原抑制50%所需的量，以酶单位mg蛋白-1表示。根据Samantary估算CAT活性，以每mg蛋白l min内分解mM H2O2量表示。在含有 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0), 10mM H2O2和酶等分试样的反应混合物中测定CAT酶活
16、性。 随后在240nm波长处分解H2O2。测定pox活性就是测定pox分解h2o2的比率，这与愈创木酚作为供氢体时，通过分 光光度法测定由于愈创木酚氧化在436nm处颜色上升的比率一致。按照Lowry的方法使用 碱性酒石酸铜试剂对蛋白质含量进行定量分析。4硒浓度为了测定硒，叶片和种子在去离子水，十二烷基硫酸钠，和去离子水中洗涤(重复3 次)。所有玻璃器皿保持在1 %硝酸中至少48小时，并在随后使用前用去离子水洗涤三次。 洗涤后的叶片和种子，放置在薄纸上以吸除多余水分，并在烘箱中保持干燥。已称重的干的 叶片和种子研磨好后转移到消解管(加入10ml 4M硝酸溶液)并保持过夜。12小时后，将 内含物放在125C的炉中加热4小时。然后将内含物冷却并过滤，将滤液定容至10ml。包 括参照番茄叶片消化来计算这个方法的准确性oVarian原子吸收光谱仪(AA-240Z, Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)与配有 Varian
