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1、小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定及逆转录（RT）-PCR实验名称：小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定及逆转录（RT）-PCR实验目的：1、掌握 RNA 操作注意事项2、了解 RNA 抽提原理3、熟悉 RNA 抽提方法4、了解鉴定 RNA 含量和质量的方法5、了解逆转录（RT）-PCR方法实验原理：真核生物中绝大多数基因有内含子，如直接由基因组克隆目的基因，不利于编码基因的 序列分析及体外利用原核细胞表达。提取 RNA 并逆转录形成 cDNA 或构建 cDNA 文库 是获取真核生物表达基因的主要手段。 检测基因在转录水平的表达，需检测 mRNA 含量，定量 RT-PCR 是主要方法之一。 实验基础：酸
2、性酚法；四步骤 （组织或细胞匀浆、 分离总 RNA、 纯化 RNA、 检测 RNA 的纯度及完整性）酸性酚法：在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA,同时酚又是蛋白变性剂。利 用酸性酚试剂加氯仿共抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与 RNA 的分离。最后 利用异丙醇沉淀,即可获得纯化的总 RNA。实验步骤：1、准备工作：去除外源性 RNA 酶。2、处死小鼠。3、取小鼠肝组织匀浆，取肝50100mg Trizol （酸性酚+异硫氰酸胍）1ml。4、 加入氯仿0.2ml，剧烈振荡15s，室温放置10min。12000rpm， 15min，取上清 置一新 EP 管。 （离心后溶液分为三相，即上
3、层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。）5、 加入异丙醇0.5ml，振荡混匀，室温放置10min， 12000rpm,10min，弃上清。 （加入 50的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。）6、1ml 75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm,5min，重复一次。7、 空气干燥沉淀5-8min，溶解于20l DEPC-H20。留样2p l，其余一70C保存备 用。8、RNA 的纯度与含量检测：紫外分光光度法高纯度 RNA 的 A260/A280 应处于 1.6 至 1.8 之间， A260 与 RNA 浓度呈正比， 1OD =40
4、g/ml RNAo RNA 浓度（g/p l） = A260 X40X稀释倍数/10009、加 1.5 l RNA 溶液于 Nanodrop 仪检测，读取 260nm 与 280nm 的吸光度数值及RNA 浓度。10、 制备琼脂糖凝胶：首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水，冷却至60C。加入5X 甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml，37%甲醛水溶液9ml，混合均匀并灌制胶板。11、取1p l RNA溶液，加入甲酰胺-上样缓冲液91,95C变性5分钟，迅速冰浴冷却。点样。12、150V 电泳 30 分钟，紫外灯下观察电泳结果。实验结果：结果讨论：RNA 为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再
5、进行甲醛变性琼脂糖凝胶电 泳。细胞总 RNA 以 rRNA 含量最高，电泳时观察到 18S 与 28S rRNA 两条清晰条带，且亮 度之比接近 1:2，表明 RNA 没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱 的条带，主要由 5S、 5.8S rRNA 与 tRNA 组成 。本小组两名成员的结果均为三条带， 说明实验结果较好。实验注意事项：RNA化学性质活泼，RNA酶分布广、活性强、且难以失活，使RNA极易降解, 操作时应特别注意：以 0.1% DEPC 处理水处理实验器皿，烤干，以0.1% DEPC处理水作为所有试剂配置用水，并高压消毒，抽提RNA时，应戴手 套和口罩，少说话。
