聚丙烯酰胺凝胶电泳)

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。 作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形 式：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态， 并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈 梯度分开。 而 SDS-PAGE 仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开 蛋白质。该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和丙 烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主 要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。SDS 是阴离子去污剂， 作为变性剂和助溶试剂， 它能断裂分子内和分子间

2、 的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯 基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中 加入还原剂和 SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样 就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE 一般采用的是 不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩 胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓 缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品 液和浓缩胶选 TRIS/HCL 缓冲液，电极液

3、选 TRIS/ 甘氨酸。电泳开始后， HCL 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因 此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电 泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电 场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根 离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成 一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子 质量，而与所带电荷和分子形状无关。聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE （Polyacrylamide gel electrophoresis ） 聚丙烯酰氨凝胶

4、电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝 胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完 成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过 硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED ）为加速剂。在聚合过程 中， TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲 叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE 根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统 电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠 电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓

5、冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效 应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连 续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为PH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而 成的小孔胶，凝胶缓冲液为 pH8.9 Tris-HC1 。电极缓冲液是 pH8.3 Tris- 甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形 成了凝胶孔径、 pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要 因素。编辑本段过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它

6、的迁移率取决于它所带净电荷 以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电 泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967 年， Shapiro 等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（ SDS ）具有这种作 用。当向蛋白质溶液中加入足够量 SDS 和巯基乙醇， SDS 可使蛋白质分子中 的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质 SDS 复合物 都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因 而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别， SDS 与蛋白质结合后，还可引起 构象改 变，蛋白质 SDS 复合物形成近似“雪茄烟”形

7、的长椭圆棒，不同 蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 18A ，这样的蛋白质 SDS 复 合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决 于分子量的大小由于蛋白质 SDS 复合物在单位长度上带有相等的电荷， 所 以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙 烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小， 迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电 泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而 SDS 聚丙烯酰胺凝 胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时， 蛋

8、白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX ，式 中： MW 为分子量， X 为迁移率， k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋 白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相 同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白 质通常在 SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的， 它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过 电泳还可以同时得到关于分子量的情

9、况，这些信息对于了解未知蛋白及设 计提纯过程都是非常重要的。编辑本段常见问题及分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9 ； 而电泳缓冲液使用的Tris 甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱 酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子 却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着 蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由 于胶中 pH 的增加，

10、呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯 离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据 其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况， 应首要考虑该因素。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化 作用的还原 SDS 处理。1）还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS和DTT （或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电

11、泳均按这 种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer ，离心，沸水煮 5min ， 再离心加样。2）带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸 胺可捕集过量的 DTT ，而防止银染时的纹理现象。 100ul 样品缓冲液中 10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温 30min 。3）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1SDS 沸水中煮 3min ，未加还原剂，因 而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE 电 泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙

12、烯酰胺与为蛋白 质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环 境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7 ，分离胶选择 pH8.9 ， 选择 trisHCL 系统， TEMED 与 AP：AP 提供自由基， TEMED 是催化剂，催 化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（ SDS ）：阳离子去污剂， 作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏 水作用、去多肽折叠。 4. 提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？ 聚 丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝 固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱

13、放置，前者 易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天， SDS 可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色 三种染料， 不同染料又各自不同的染色方法， 具体可参照郭尧君编著的 蛋 白质电泳技术手册 P82-103 。5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚 的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉” （两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中， 一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什么带

14、出现拖尾现象？ 主 要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前 离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长， 重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是 样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心； 加适量样品促溶剂。9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂 的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子 未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而 失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合， 聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶

15、。但它却 于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的 抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯 基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚 蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的 浓度有关。 处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer ；降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未 浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液 的 pH 正确（ 6.7）；适

16、当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流 却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括： a. 内外槽装反； b. 外槽液过少； c. 电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶 用的橡胶皮)。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 13. 浓缩胶 与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者 中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或 过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起 的。 14. 凝 胶 时间不对 ， 或慢 或 快，怎么 回事？通常胶 在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED , APS剂量不够或者失效。APS 应该现配现用， TEMED 不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是 APS 和 TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15. 电