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1、实验室常用技术参数资料一、核酸及蛋白质常用数据 1核苷三磷酸的物理常数 化合物 分子量 max(pH7.0) 1摩尔溶液（pH7.0）中max时的最大吸收值 OD280/OD260 ATP 507 259 15400 0.15 CTP 483 271 9000 0.97 GTP 523 253 13700 0.66 UTP 484 262 10000 0.38 dATP 494 259 15200 0.15 dCTP 467 271 9300 0.98 dGTP 507 253 13700 0.66 dTTP 482 267 9600 0.71 2常用核酸的长度与分子量 核酸 核苷酸数 分子量
2、 DNA 48502（双链环状） 3.0107 pBR322 4363（双链） 2.8106 28SrRNA 4800 1.6106 23SrRNA 3700 1.2106 18SrRNA 1900 6.1105 19SrRNA 1700 5.5105 5SrRNA 120 3.6104 tRNA（大肠杆菌） 75 2.5104 3常用核酸蛋白换算数据 （1）重量换算 1g=10-6g 1pg=10-12g 1ng=10-9g 1fg=10-15g （2）分光光度换算： 1A260双链DNA=50g/ml 1A260单链DNA=30g/ml 1A260单链RNA=40g/ml （3）DNA摩尔
3、换算： 1g 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端 1g pBR322 DNA=0.36pmol 1pmol 1000bp DNA=0.66g 1pmol pBR322=2.8g 1kb双链DNA（钠盐）=6.6105道尔顿 1kb单链DNA（钠盐）=3.3105道尔顿 1kb单链RNA（钠盐）=3.4105道尔顿 （4）蛋白摩尔换算： 100pmol分子量100，000蛋白质=10g 100pmol分子量50，000蛋白质=5g 100pmol分子量10，000蛋白质=1g 氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿 （5）蛋白质/DNA换算： 1kb DNA=333 个氨基
4、酸编码容量=3.7104MW蛋白质 10，000MW蛋白质=270bp DNA 30，000MW蛋白质=810bp DNA 50，000MW蛋白质=1.35kb 100，000MW蛋白质=2.7kb DNA 4常用蛋白质分子量标准参照物 （1）高分子量标准参照 （2）中分子量标准参照 （3）低分子量标准参照 肌球蛋白 分子量 磷酸化酶B 97，400 碳酸酐酶 31，00 肌球蛋白 212，000 牛血清白蛋白 66，200 大豆脻蛋白酶 21，500 -半乳糖甘酶B 116，000 谷氨酶脱氢酶 55，000 抑制剂 磷酸化酶B 97，400 卵白蛋白 42，700 马心肌球蛋白 16，90
5、0 牛血清白蛋白 66，200 醛缩酶 40，000 溶菌酶 14，400 过氧化氢酶 57，000 碳酸酐酶 31，000 肌球蛋白（F1） 8，100 醛缩酶 40，000 大豆脻蛋白酶 21，500 肌球蛋白（F2） 6，200 抑制剂 肌球蛋白（F3） 2，500 溶菌酶 14，400 5常用DNA分子量标准参照物 DNA/Hind DNA/EcoR /Hind+EcoR pBR322/Hae 23130 21226 21227 587 123 9416 7421 5148 405 104 6557 5804 4973 504 89 4361 5643 4268 458 80 2322
6、 4843 3530 434 64 2027 3530 2027 267 57 564 1904 234 51 125 1584 213 21 1375 192 18 974 184 11 831 124 7 564 125 续上表 pBR322/Hinf 174/Hinf 174/Hae 174/Tap 1631 726 140 1353 2914 517 713 118 1078 1175 506 553 100 872 404 396 500 82 603 327 344 417 66 310 231 298 413 48 281 141 221 311 42 271 87 220 24
7、9 40 234 54 154 200 24 194 33 75 151 118 20 72 二、常用缓冲液 1分子克隆常用缓冲液 2磷酸缓冲液 （1）25下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制 pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml) 5.8 8.5 91.5 6.0 13.2 86.8 6.2 19.2 80.8 6.4 27.8 72.2 6.6 38.1 61.9 6.8 49.7 50.3 7.0 61.5 38.5 7.2 71.7 28.3 7.4 80.2 19.8 7.6 86.6 13.4 7.8 90.8 9.2 8.0 94.0 6.2
8、 （2）25下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制 pH 1mol/L Na2HPO4(ml) 1mol/L NaH2PO4(ml) 5.8 7.9 92.1 6.0 12.0 88.0 6.2 17.8 82.2 6.4 25.5 74.5 6.6 35.2 64.8 6.8 46.3 53.7 7.0 57.7 42.3 7.2 68.4 31.6 7.4 77.4 22.6 7.6 84.5 15.5 7.8 89.6 10.4 8.0 93.2 6.8 :用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值： pH=pK
9、+1g(质子受体/质子供体) 在此，pK=6.86(25)。 3电泳缓冲液 测序凝胶加样缓冲液 98%去离子甲酰胺 10mol/L EDTA(pH8.0) 0.025%二甲苯青FF 0.025%溴酚蓝 甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70。 常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1：0.04mol/L Tris-乙酸 50：242g Tris
10、碱 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1:0.09mol/L Tris-磷酸 10:10g Tris碱 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.50.045mol/L Tris-硼酸 5：54g Tris碱 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1:50mmol/L NaOH 1:5ml 10mol/L
11、NaOH 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1:25mmol/L Tris 5:15.1g Tris 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3） 0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级) 说明： TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5溶液，出现沉淀后则予以废弃。 以片都以1TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。 进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓
12、冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1TBE以提供足够的缓冲容量。 碱性电泳缓冲液应现用现配。 Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2SDS凝胶加样缓冲液： 100mmol/L TrisHCl(6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2%溴酚蓝 20%甘油 不含DTT的2SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。 4凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6缓冲液 贮存温度 0.25%溴酚蓝 4 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 0.25溴酚蓝 室温 0.25%二甲苯青FF 15
13、%聚蔗糖(Ficoll400) 0.25%溴酚蓝 4 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 4 40%(W/V)蔗糖水溶液 碱性加样缓冲液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4 0.15%溴甲酚绿 0.25%二甲苯青FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长3
14、00bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。 5各种pH值的Tris缓冲液的配制 各种pH值的Tris缓冲液的配制 所需pH值（25） 0.1mol/L HCl的体积 71 457 72 447 73 434 74 420 75 403 76 385 77 366 78 345 79 320 80 292 8.1 26.2 8.2 22.9 8.3 19.9 8.4 17.2 8.5 14.7 8.6 12.4 8.7 10.3 8.8 8.5 8
