噬菌体展示技术解析

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1、噬菌体展示技术解析噬菌体展示技术解析噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设 计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位 研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模 拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体 生成过程，构建高亲和力抗体库。由于噬菌体展 示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究 者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体 外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达 产物提供了强有力手段。另外，噬菌体展示技术 已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途 径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值 的单克隆抗体提供了重要手段。应用面这么高大上，那

2、么原理到底是什么 呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！一、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术(phage display )是将多 肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结 构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他 外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的 重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表 面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生 物活性，可以与靶分子结合和识别。噬菌体展示 的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的 噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合 的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增， 经过3-5轮的富集，逐步提高

3、可以特异性识别靶 分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。下图粗略展示了技术筛选的过程:二、噬菌体展示系统的分类1. M13噬菌体展示系统M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因 组为6.4 kb，编码10种蛋白，其中5种为结构 蛋白，包括主要衣壳蛋白的 PW和次要衣壳的 pM、pF、P% 和 PK 。其中，pH 和 PW 是 噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了 pH和 PW展示系统。pH蛋白分子量为42 kDa，分 布在噬菌体颗粒的一端。一般一个噬菌体有 3-5 个拷贝的pH蛋白，可在N端的柔性连接区插 入外源蛋白或者多肽。pH系统的主要优点是对 展示的外源蛋白大小无严格的要

4、求， 该系统可以 用来展示分子量较大的蛋白。PW蛋白的分子量 为5.2 kDa，主要分布在噬菌体颗粒的两侧。由 于该蛋白的分子量很小，只适合用来展示外源短 肽。外源肽段的太大会影响病毒包装， 不能形成 有功能的噬菌体。但由于pH蛋白拷贝数较多，该系统比较适合用来筛选低亲和力的配体。pixpVIIIpvi2. 入噬菌体展示系统入噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌 体，有直径55nm的二十面体头部，末端有细长 尾丝。基因组为48.5 kb的线性双链DNA分子， 有黏性末端即单链延伸12个核苷酸，感染后线 性基因组可立即环化。噬菌体的头部由D蛋白和 V蛋白构成，可以构建D蛋白和V蛋白的展示系 统。入

5、噬菌体是在宿主细胞内完成装配的，无需 将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示有活 性的大分子蛋白质(100 kDa以上蛋白质)及宿主 细胞有毒性的蛋白质，适用范围极广。3. T4噬菌体展示系统T4噬菌体基因组DNA为双链线形，呈环状 排列，噬菌体衣壳的有两种非必需外壳蛋白： SOC(small outer capsid protein) 禾口 HOC(highly antigenic outer capsid protein)。 T4噬菌体表面展示是将外源多肽或蛋白质分别 与SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合 而展示于T4噬菌体表面。T4噬菌体的主要优点 是可以实现SOC位点和HOC位

6、点同时展示，展示 的拷贝数也较多。4. T7噬菌体展示系统T7噬菌体基因组为线性双链 DNA其衣壳 蛋白通常有两种形式，即10A（344个氨基酸残基 和10B（397个氨基酸残基），10B衣壳蛋白区存 在于噬菌体表面，所以被用来构建噬菌体展示系 统。T7噬菌体展示系统可以高拷贝展示 50个氨基酸的多肽，以低拷贝量（0.1-1/噬菌体）或以中 拷贝量（5-15/噬菌体）展示1200个氨基酸残基 的多肽或蛋白质。因此，广泛应用于筛选不同分子量，不同亲和力的蛋白质0000 龜PVII/DVIIIPVIPIII三、噬菌体展示技术的应用1. 抗体筛选将抗体可变区的基因插入噬菌体基因组中， 表达的抗体展示

7、到噬菌体的表面，构建噬菌体展 示抗体库，可以在体外模拟抗体生成的过程，筛 选针对任何抗原的抗体。相对于杂交瘤技术，通 过噬菌体展示抗体库技术筛选抗体，可以不经过 免疫，缩短抗体生产的周期。也可以筛选在体内 免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗体，适用范 围广。噬菌体展示抗体库技术不受种属的限制， 可以构建各种物种的抗体库。从人天然库中筛选 到的抗体，可以不经过人源化过程，直接用于抗 体药物研究。2. 新受体和配体的发现将随机多肽序列展示到噬菌体的表面，获得 噬菌体展示多肽库。用细胞作为筛选靶标，经过 差异筛选，获得出识别特定细胞的多肽。通过研 究该多肽序列，可以进一步得到细胞表面特异性 表达的受体

8、蛋白。用HCT116细胞筛选12肽库， 从库中筛选出了可以特异性行识别结肠癌细胞 的多肽。进一步分析分析发现，该多肽可以特异 性识别a-enolase。该蛋白有望作为结肠癌治疗 的靶标，筛选结肠癌治疗药物。获得的多肽序列， 也可以作为抗癌药物的运送载体。3. 蛋白质相互作用研究蛋白质的相互作用是生命过程中所不可缺 少的，噬菌体展示的多肽文库是由特定长度的随 机短肽序列组成。用靶蛋白质（如受体）对该随机 文库进行亲和淘选，就可以获得与之结合的短肽 序列。对所得序列测序分析，并合成相应的短肽， 从而可以来研究两个蛋白质之间的相互作用。 利 用这种方法已经成功鉴定出多个重要大分子，如 生长激素受体、

9、胰岛素受体、胰岛素样生长因子 受体和TNF-a受体的激动剂和颉颃剂等。4. 抗原表位分析用抗体作为筛选的蛋白，从噬菌体展示的随 机多肽库中，筛选出可以与抗体特异性结合的噬 菌体，经测序分析，获得该抗体识别的抗原表位。 该技术为抗原抗体反应机制研究，诊断试剂开 发，疫苗制备等提供依据。目前的表位鉴定技术能够实现： 单抗药物及诊断用单抗的制备； 研制包括“通用”目标在内的治疗性和预防性 重组多价肽疫苗； 研制单表位或重组多表位肽检测抗原； 筛选基于表位基序的疾病、肿瘤等新的特异诊断标志物； 高通量发现同源蛋白中全部保守性和特异性 表位； 筛选功能性抗体表位或者抗体中和性及可及 性表位； 为表位水平

10、分析病毒遗传进化和变异，提供抗 原漂移和转移的直接证据。5. 抗体人源化改造单抗人源化比例不断升高，单抗的药物靶位 逐渐多样化，除了传统的细胞表面抗原，还包括 了常见的细胞因子，部分研制中的单抗药物甚至 可以识别多个抗原表位，而且单抗药物的结构也 不限于完整的单抗分子。联合小分子等的治疗方 案逐渐增加，日益受到医疗工作者的重视。因此, 作为一种高科技含量的药物，单抗药物企业的科 技水平决定了其竞争力，也决定了药物的治疗效 果和市场价值。6. 双特异性抗体（BsAb制备通过基因工程手段将两个分别靶向不同抗 原的抗体片段组合在一起，具有两种抗原结合位点，可以发挥协同作用，进而提高治疗效果。但 是双

11、特异性抗体的种类较多，选择时根据最终的 应用来做判断。7. 酶抑制剂筛选3 -酮脂酰-ACP还原酶是原核生物脂肪酸 生物合成代谢中高度保守和广泛存在的酶， 用此 蛋白为筛选的靶蛋白，从噬菌体肽库中筛选出了 该酶的抑制剂，可以作为新型的抗菌剂。已针对 乙酰胆碱酯酶、海藻糖酶、乙酰乳酸合成酶、乙 酰CoA羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶标酶，开 发和研制了一系列高效的杀虫剂和除草剂。8. 蛋白质的定向改造蛋白质的定向改造是指用盒式突变、 错误倾 向PCR等方法来突变蛋白质或者结构域的某一 特定编码序列，产生蛋白质或结构域的突变文库 呈现在噬菌体表面，通过亲和筛选获得所需的已 定向改变的噬菌体克隆，他们的

12、一级结构可以从 DNA勺序列中推导出来，可用来筛选具有更强受 体结合能力的细胞因子、新的酶抑制剂、转录因 子的DNA吉合新位点、新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学活性的蛋白质等。三、金开瑞噬菌体展示定制服务类型1. 天然/免疫抗体库构建(人、小鼠、兔、羊驼 等)2. 抗原表位鉴定3. 蛋白质相互作用研究4. 抗体筛选5. 抗体人源化6. 抗体亲和力成熟7. 重组抗体改造参考文献：Azzazy, H. M. and W. E. Highsmith, Jr. (2002). Phage display technology: clinical applicati ons and rece nt

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