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1、附件3：辅助降血糖功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 动物实验分为方案一（胰岛损伤高血糖模型）和方案二（胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型）两种1.1.1 方案一（胰岛损伤高血糖模型）1.1.1.1 体重1.1.1.2 空腹血糖1.1.1.3 糖耐量1.1.2 方案二（胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型）1.1.2.1 体重1.1.2.2 空腹血糖1.1.2.3 糖耐量1.1.2.4 胰岛素1.1.2.5 总胆固醇1.1.2.6 甘油三酯1.2 人体试食试验1.2.1 空腹血糖1.2.2 餐后2小时血糖1.2
2、.3 糖化血红蛋白（HbA1c）或糖化血清蛋白1.2.4 总胆固醇1.2.5 甘油三酯 2 试验原则2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。2.2 根据受试样品作用原理不同，方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。2.3 除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外，应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。2.4 人体试食试验应在临床治疗的基础上进行。2.5 应对临床症状和体征进行观察。2.6 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3 结果判定3.1 动物实验： 方案一：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品
3、辅助降血糖功能动物实验结果阳性。 方案二：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，血脂（总胆固醇、甘油三酯）无明显升高，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。3.2 人体试食试验：空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）、血脂四项指标均无明显升高，且空腹血糖、餐后2小时血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无影响，可判定该受试样品具有辅助降血糖功能的作用。29辅助降血糖功能检验方法Method for the Assessment of Assisting Blood Sugar Reduction Function1.动物实验1.1实验
4、动物选用成年动物，选用小鼠（262g）或大鼠（18020g），单一性别，大鼠每组812只、小鼠每组1015只。1.2材料1.2.1试剂四氧嘧啶（C4H2N2O4H2O,分子量160.08）或链脲佐菌素、地塞米松磷酸钠注射液、葡萄糖或医用淀粉、血糖测定试纸或试剂盒，胰岛素、甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒1.2.2 高热能饲料猪油10% 、蔗糖15% 、蛋黄粉15% 、酪蛋白5% 、胆固醇1.2% 、胆酸钠0.2% 、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持料52.6% 1.2.3仪器血糖仪、全自动生化仪、可见光分光光度计、酶标仪、天平。1.3剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个模型对照组
5、，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设空白对照组。同时设给予受试样品高剂量的正常动物组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.4实验方法1.4.1 正常动物降糖实验选健康成年动物按禁食35小时的血糖水平分组，随机选1个对照组和1个剂量组。对照组给予溶剂，剂量组给予高剂量浓度受试样品，连续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较两组动物血糖值。1.4.2 高血糖模型降糖实验方案一1.4.2.1胰岛损伤高血糖模型1.4.2.1.1原理四氧嘧啶（或链脲佐菌素）是一种细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛细胞，造成
6、胰岛素分泌低下，引起实验性糖尿病。1.4.2.1.2造模方法购入成年动物，适应1天后，随机取15只动物禁食35小时，测空腹血糖，作为该批次动物基础血糖值。随后动物禁食24小时（自由饮水），注射四氧嘧啶（用前新鲜配制）造模，小鼠4550mg/kg BW.iv或125130mg/kg BW.ip，大鼠5080mg/kg BW.iv或120160mg/kg BW.ip。57天后动物禁食35小时，测血糖，血糖值1025mmol/L为高血糖模型成功动物。1.4.2.1.3高血糖模型动物降糖实验选高血糖模型动物按禁食35小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组（组间差不大于1.1mmol/L）
7、。剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。（实验前血糖值实验后血糖值）血糖下降率%= -100实验前血糖值1.4.2.1.4高血糖模型动物糖耐量实验剂量分组及受试样品给予时间同1.4.2。各组动物禁食35小时，测定给葡萄糖或医用淀粉前（即0小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，1520分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kg BW或医用淀粉35g/kg BW，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值或给医用淀粉后1、2小时的血糖值，观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时
8、间点（0、0.5、2小时）血糖值及血糖曲线下面积的变化。（0小时血糖0.5小时血糖）0.5 （2小时血糖0.5小时血糖）1.5 血糖曲线下面积 + 2 2方案二1.4.2.2胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型(任选其一)1.4.2.2.1地塞米松诱导胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型1.4.2.2.1.1原理糖皮质激素具有拮抗胰岛素生物效应的作用，可抑制靶组织对葡萄糖的摄取和利用，促进蛋白质和脂肪的分解及糖异生作用，导致糖、脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病。1.4.2.2.1.2试验方法购入健康雄性大鼠（15020g），普通维持料适应饲养35天，禁食34小时，取尾血，测定空腹即给葡萄糖前（0小时）血糖
9、值，给2.5g/kgBW葡萄糖后测定0.5、2小时血糖值，作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分5个组，即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组，每组15只。空白对照组不做处理，3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续35天。各组给予维持料饲养，1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料，喂饲2周后，模型对照组和3个剂量组在高热能饲料基础上分别给予地塞米松0.8mg/kgBW腹腔注射（0.008%地塞米松注射量1ml/100g体重），每日1次，连续1012天。试验结束，各组动物禁食34小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。1.4.
10、2.2.1.3 观察指标1.4.2.2.1.3.1 空腹血糖、糖耐量各组动物禁食34小时，测定空腹血糖即给葡萄糖前（0小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，空白对照组不做处理，1520分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kg BW，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值，若模型对照组0.5小时血糖值10mmol/L，或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型糖代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后（0.5、2小时）血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。（实
11、验前血糖值实验后血糖值）血糖下降率%= -100实验前血糖值（0小时血糖0.5小时血糖）0.5 （2小时血糖0.5小时血糖）1.5 血糖曲线下面积 + 2 21.4.2.2.1.3.2 胆固醇、甘油三脂各组动物禁食34小时，检测血清胆固醇、甘油三脂，若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型脂代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组血脂变化。1.4.2.2.1.3.3 胰岛素各组动物禁食34小时，检测血清胰岛素，模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降，且动物糖/脂代谢紊乱成立，判定胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受
12、试样品组胰岛素抵抗情况。 血糖胰岛素胰岛素抵抗指数 = 胰岛素/22.5e-血糖 22.51.4.2.2.2四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型1.4.2.2.2.1原理高热能饲料喂饲基础上，辅以小剂量四氧嘧啶（C4H2N2O4H2O,分子量160.08），造成糖/脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病。1.4.2.2.2.2造模方法购入健康雄性大鼠（15020g），普通维持料适应饲养35天，禁食34小时，取尾血，测定给葡萄糖前（即0小时）血糖值，给2.5g/kgBW葡萄糖后0.5、2小时血糖值，作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分5个组，即1个空白对照组、1个模型对照组和3个
13、剂量组，每组15只。空白对照组不做处理，3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续33天。各组给予维持料饲养，1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料，喂饲3周后，模型对照组和3个剂量禁食24小时（不禁水），给予四氧嘧啶103105mg/kgBW腹腔注射，注射量1ml/100g体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲35天。试验结束，各组动物禁食34小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。1.4.2.2.2.3 观察指标1.4.2.2.2.3.1空腹血糖、糖耐量各组动物禁食34小时，测定空腹血糖即给葡萄糖前（0小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，空白对照组不做处理，1520分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kg BW，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值，若模型对照组0.5小时血糖值10mmol/L，或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型糖代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后（0.5、2小时）血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。（实验前血糖值实验后血糖值）血糖下降率%= -100实验前血糖值（0小时血糖0.5小时血糖）0.5 （2小时血糖0.5小时血糖）1.5 血糖曲线下面积 + 2
