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1、液质联用法测定甲磺酸仑伐替尼中甲磺酸酯类基因毒性杂质 含量摘要：甲磺酸酯类属于烷化剂，可能引起基因损伤，具有潜在的遗传毒性，根 据ICH M7指导原则，按毒理学关注阈值TTC法计算：每日摄入限度为1.5用/人/ 天，本品每日最大摄入量为29.4mg，TTC=（1.5用/人/天）/（29400用/天） =0.005%，故拟定362项目中磺酸酯类的限度均为0.005%。本公司采用气相色谱 法和质谱法自主开发四种磺酸酯类的测定方法，根据中国药典2015年版四部通 则对测定方法进行方法学验证，验证的内容包括专属性、检测限与定量限、线性 和范围、准确度、重复性和耐用性。关键词：甲磺酸酯；含量测定；方法分
2、析1.试剂信息表1验证使用的仪器与试药信息3.分析方法色谱柱：Agilent DB-624 毛细管柱（30mx0.32mmx1.8Rm）柱温：120C保持5分钟，25C/分钟升温至230C，保持10分钟进样口温度：250C柱流速：1.5ml/min进样方式：直接进样检测器：质谱检测器（EI），选择SIM模式，甲磺酸甲酯选择离子为65/79/95；甲磺酸 乙酯选择离子为79/97/109；甲磺酸异丙酯选择离子为79/123；甲磺酸丙酯选择离子为 79/97/109o离子源温度：230C四级杆温度：150C进样体积：1Rl分流比：5： 1载气：氮气稀释剂：二氯甲烷供试品溶液：取本品约40mg,精密
3、称定，置于15ml离心管中，加5ml二氯甲烷和5ml 水，振摇2min，于每分钟8000rpm的转速下离心5分钟，取下层二氯甲烷层滤过作为供试 品溶液。对照品溶液：取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸异丙酯各适量，精密称 定，分别加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中各约含甲磺酸甲酯0.4曲、甲磺酸乙酯0.4曲、 甲磺酸丙酯0.4曲、甲磺酸异丙酯0.4曲的溶液，作为对照品溶液。混合溶剂溶液：取丙酮、异丙醇、乙醇、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、正丙醇、二甲基亚 砜、N，N-二甲基甲酰胺、毗啶、甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸异丙酯各 适量，精密称定，加溶剂定量稀释制成每lml中分别含丙
4、酮100曲、异丙醇100曲、乙醇 100曲、正丙醇100曲、乙酸正丙酯100曲、乙酸异丙酯100曲、二甲基亚砜100曲、N，N-二 甲基甲酰胺17.6曲、毗啶4曲、甲磺酸酯类各0.4曲的混合溶液，即得；标记供试品溶液：取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸异丙酯各适量，精 密称定，分别加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中各约含甲磺酸甲酯40曲、甲磺酸乙酯 40曲、甲磺酸丙酯40曲、甲磺酸异丙酯40曲的溶液，作为混合对照品溶液；取362-1约 40mg，精密称定，置于15ml离心管中，加入混合对照品溶液50叫，加5ml二氯甲烷和5ml 水，振摇2min，于每分钟8000rpm的转速下离心5
5、分钟，取下层二氯甲烷层滤过作为标记 供试品溶液。照上述色谱条件，分别精密量取上述溶液各1B，注入气相色谱仪，记录色谱图，要求 空白溶剂和工艺有关溶剂不干扰各溶剂测定，各溶剂峰之间分离度大于1.5，样品不干扰各 溶剂测定。具体试验结果见表3表4，图1图5。表3专属性试验结果结果表明：在质谱的SCAN模式确定各已知杂质特征离子分别为甲磺酸甲酯选择离子（m/z） 为65/79/95，甲磺酸乙酯选择离子为79/97/109，甲磺酸异丙酯选择离子为79/123，甲磺酸 丙酯选择离子为79/97/109；选择丰度较强的杂质作为检测离子分别为甲磺酸甲酯m/z79，甲 磺酸乙酯m/z79，甲磺酸异丙酯m/z1
6、23和甲磺酸丙酯m/z109在各离子通道下，空白溶剂不 干扰杂质检测，二甲基亚砜与甲磺酸甲酯之间分离度为1.6；标记供试品溶液与混合对照品 溶液中各成分峰保留时间一致，样品不干扰各溶剂测定。5. 线性和范围取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸异丙酯各适量，精密称定，用稀释剂 定量稀释制成相当于各溶剂限度浓度的10%、20%、40%、80%、100%、120%、150%与200% 系列浓度的溶液，分别作为系列线性溶液。照上述色谱条件，分别精密量取上述线性溶液各 1B，注入气相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度（Rg/ml）为横坐标（x），平均峰面积为纵 坐标（y），进行线性回归分析，要求峰面
7、积与浓度呈良好线性关系，线性相关系数（r）不 小于0.990，Y轴截距偏差不大于25%，响应因子RSD不大于15%。6. 检测限与定量限取已知浓度的各溶剂对照品贮备液用稀释剂逐级定量稀释到低浓度溶液，照上述色谱条 件，分别精密量取1B，注入气相色谱仪，记录色谱图，根据信噪比法确定检测限（LOD）与 定量限（LOQ）。要求LOD浓度溶液连续进样3次，测定的信号与空白处的信号（基线噪音） 进行比较（S/N）均不小于3；定量限浓度溶液连续进样6次，测定的信号与空白处的信号 （基线噪音）进行比较（S/N）均不小于10，定量限浓度不大于限度的50%，定量限6针各 溶剂峰保留时间的RSD不大于1%，峰面积
8、的RSD不大于20%，来证实方法具有良好的灵敏 度。结果表明：各溶剂检测限浓度相当于样品浓度量的0.000125%，检测限溶液连续进样3 针各溶剂峰信噪比均大于3，定量限浓度相当于样品浓度量的0.00025%，定量限浓度均低于 限度的30%，定量限溶液连续进样6针信噪比均大于10，峰面积的RSD在8.1%14.4%范围 内，保留时间的RSD在0.0%0.1%范围内，符合灵敏度要求。7. 准确度准确度是通过在供试品中加入限度浓度30%、50%、100%、150%三个不同浓度各溶剂， 每个浓度平行配制3份溶液，共12份溶液，照上述色谱条件，分别测定。计算加标供试品 溶液中各溶剂含量（测得量）和供试
9、品溶液中各溶剂含量（原有量），计算各溶剂测定值与 理论值（加入量）之间的比值获取回收率，要求各溶剂平均回收率在80%120%之间，RSD 不大于15%，证实方法具有良好的准确度。8. 精密度8.1进样精密度照专属性”项下配制对照品溶液，照上述色谱条件，精密量取1R1，连续进样6次，记录 色谱图，计算峰面积和保留时间RSD。要求各溶剂峰保留时间的RSD不大于1%，峰面积的 RSD不大于5%，来证实仪器方法具有良好的精密度。试验结果见表5。表5进样精密度试验结果表9标记供试品溶液稳定性试验结果从以上数据可以看出，对照品溶液放置24h内，各考察时间点待测溶剂的峰面积的RSD在 12.9%13.9%范
10、围内，标记供试品溶液放置24h内，各考察时间点待测溶剂的峰面积的RSD 在11.0%13.9%范围内，均符合验证要求。因此对照品溶液和标记供试品溶液在24h内稳定 性良好。10耐用性照专属性”项下配制100%限度浓度的标记供试品溶液和对照品溶液。适当调整色谱参数 （具体色谱参数见表20），考察色谱参数微小变动后对系统适用性及供试品测定结果的影响。 要求各溶剂峰分离度大于1.5，不同条件下标记供试品中各溶剂测定结果与原条件测定结果 的比值在70%130%之间，则该方法在相应色谱参数下耐用。结果表明，将色谱条件中的参 数作适度变化，如初始柱温变化（1205C）、升温速率（252C/min）、载气流
11、速变化 （1.50.3ml/min）、进样口温度变化（2505C），各成分峰之间的最小分离度（甲磺酸乙 酯与甲磺酸异丙酯）最小值为6.1，理论板数均大于10000，不同条件下各成分测定结果于规 定条件下测定结果的比值在75.0%112.5%之间，说明方法的耐用性良好。经过上述方法学验证，总结甲磺酸仑伐替尼中甲磺酸酯类基因毒杂质测定方法如下：取本品约40mg，精密称定，置20ml离心管中，精密加入水5ml和二氯甲烷5ml，振摇 萃取2分钟，每分钟8000转离心5分钟，取下层有机相滤过，作为供试品溶液。取甲磺酸 甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸异丙酯对照品各适量，精密称定，用二氯甲烷溶解 并定
12、量稀释制成每1ml中约含甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯、甲磺酸异丙酯均为 0.4曲的混合溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法（中国药典2015年版四部通则0521）和 质谱法（中国药典2015年版四部通则0431）测定，以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为 固定液Agilent DB-624 UI（60mx0.32mm，1.8m）或极性相近的色谱柱的毛细管柱为色谱柱; 起始温度为120C，维持5分钟，以每分钟25C的速率升温至230C，维持10分钟；进样口 温度为250C；载气为氦气，流速为每分钟1.5ml；分流比为5： 1；采用质谱检测器，电子 轰击离子源（EI），电压为70eV，接口
13、温度为280C，离子源温度为230C，四级杆温度为 150C；检测模式为SIM模式；甲磺酸甲酯检测离子（m/z）为79，甲磺酸乙酯检测离子（m/z）为79，甲磺酸丙酯检测离子（m/z）为109，甲磺酸异丙酯检测离子（m/z）为123。 取对照品溶液1B，注入气相色谱-串联质谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为甲磺酸甲酯、 甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯与甲磺酸丙酯，各色谱峰之间分离度应符合规定。精密量取供试 品溶液与对照品溶液各1B，分别注入气相色谱-串联质谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱 图中，如有与各组分峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含甲磺酸甲酯、甲 磺酸乙酯、甲磺酸丙酯与甲磺酸异丙酯均不得过0.005%，杂质总量不得过0.005%。本品样品（批号：142181201、142181202、142181203、142190801、142190901、 142190902）磺酸酯类测定结果见表10。表10磺酸酯类测定结果
