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1、第六章 无菌动物、悉生动物和无特定病原体动物的特点及应用第一节 无菌动物一、无菌动物的基本概念所谓无菌动物，就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。从微生物 学的观点看，通常实验动物的体内和体外带有寄生虫，体内还常带有细菌和病毒， 而且还都难于排除某些潜在的传染病。此外，普通实验动物的血清中含有抗体。 所以用并存普通动物进行医学科学研究，将会存在各种各样的干扰，实验结果往 往不确切。使用无菌动物作实验就可以克服普通实验所存在缺点，使实验结果正 确可靠。无菌动物是在无菌屏障系统中，剖腹取出胎儿，饲养繁育在无菌隔离器中， 饲料、饮水经过消毒，定期检验，证明动物体内外均无一切微生物和寄生虫(包
2、括大部分病毒)的动物。无菌动物的“菌”主要是指细菌，而严格来说，还包括 真菌、立克次氏体、支原体和病毒等微生物及各种寄生虫。而所谓“无”却不是 绝对的，不过是根据现有的科学知识和检查方法在一定时期内不能检出已知的微 生物和寄生虫而已。随着科学技术的发展，现在认为是无菌的动物或许将来可以 检出微生物和寄生虫而不是无菌动物，因为这个“无”是相对而言的。到目前为 至，尚未确立无菌动物的微生物检定法，因此，研究者的检定方法各式各样，其 中病毒和立克氏体的检查尚有相当多的问题。例如，在无菌动物中供实验室使用 最多的无菌小鼠，用电子显微镜检查证明，胸腺细胞中仍有存在白血病病毒的例 子，因而，现在的所谓无菌
3、动物，指动物体内外未能检出细菌、真菌、原虫、内 外寄生虫的动物较妥当。用大量抗菌素也可以使普通动物暂时无菌，但是这种动物不是无菌动物。因 为这种无菌状态往往是一过性的，某些残存的细菌在适当的条件下又会在体内增 殖；即使能把体内细菌全部杀死，它们给动物造成的影响却是无法消除的，例如： 特异性抗体的存在、网状内皮肤系统的活化、某些组织或器官的病理变化等。因 此，无菌动物必须是生来就无菌的动物。按对微生物的控制的程度，可以将实验动物分为四类:即(1)无菌动物(Germ Free,GF)；(2)悉生动物或已知菌动物(Gno tobio tics,GN)；(3 )无特定病原体动物(Specific Pa
4、thogen Free,SPF) ； (4)通常动物(Conventional,CV)。 无菌动物和悉生动物饲养于隔离器中(隔离系统)，无特殊病原体动物饲养于屏 障系统，通常动物饲养于开放系统。通常动物是在开放系统条件下饲养的，都受到自然界微生物和寄生虫的侵 袭，一般都带细菌、病毒和寄生虫。有的动物外观看起来健康，其实都隐藏着某 些疾病或有微生物与寄生虫的感染。因此用通常动物进行实验敏感性差、反应性 不一致，实验结果缺乏再现性。要提高动物实验的准确性，就必须对实验动物在 遗传和微生物两个方面加以控制，培养出标准的合格动物，才能使实验结果正确 可靠，达到反应均一性和重复性。采用兄妹间近亲交配殖繁
5、 20 代以上所培育的 近交系动物，遗传均一、个体差异小、实验结果比较准确。但是只从遗传上加以 控制，如不进行微生物控制，没有排除自然感染的微生物和寄生虫的影响，实验 结果仍可能不准确。因此，在精度要求高的实验中，无菌动物、悉生动物和无特 殊病原体动物就成了理想的实验动物。表 6 1 按微生物控制程度的实验动物分类原则种类饲养方法说明附记无菌动物隔离系统以封闭的无菌技术取得，用现有方法不 能检出任何微生物和寄生虫的动物。悉生动物隔离系统确知所带的微生物丛（植物的和动物 的）经特殊饲养的动物。确知所带有的微生 物SPF动物屏障系统没有指定的致病性微生物和寄生虫的 动物。确知不带有的微生 物通常动
6、物开放系统不明确所带的微生物、寄生虫的动物， 赤称普通动物，但不得带有人畜共患的 传染病病原体。对微生物带有情况 不明确二、无菌动物的发展无菌动物的产生和发展，已有近百年的历史，许多学者曾对肖椎动物和脊椎 动物的无菌状态进行过反复的研究。无菌动物的研究，起源于 19世纪后期， 1885-1886 年间，确立了在动物体内没有微生物也能生存的概念。1885 年， Dudeaux 曾将豌豆在无菌条件下进行栽培，证明无菌植物不能利用供给的养分。 同年 Pasteur 认为，动物在没有肠道细菌参与条件下不能生存。1886 年 Neucki 提出相反的看法，认为细菌对于动物的生存不是必需的。因此展开了一场
7、争论。 约 10 年后，1895 年 Kijanizin 在无菌代谢试验笼内饲养兔，给予无菌空气、饲 料和水，兔的体重逐渐下降，并因负氮平衡而死亡。同年 Nuttall 和 Thierfelder 经剖腹产获得豚鼠，饲养于玻璃罩内，每小时人工哺以灭菌牛奶和纯动物性饲料 一次，共计 8天，动物外观健康，将此动物于第 8 天处死，其肠内容物没有检出 细菌。1914 年 Cohendy 也曾饲养过无菌豚鼠，但是没有获得成功。14 年后 Glimstedt 继续开展无菌豚鼠的研究，于1932 年，终于把无菌豚鼠养活两个月， 取得了初步进展，至 1959 年 Teah 在 Notre Dame 大学已能
8、使无菌豚鼠繁殖。关于无菌鸡的培育，早在1897 年 Schottelius 就曾获得，但没有继续养活。 1908 年 Cohendy 育成无菌鸡，且生长情况良好。1935 年 Kimura，Naito 和 Kobayashi 在日本京都大学饲养了无菌鸡。1944 年 Luckey 和 Lakey 又开始进行 无菌鸡饲料营养的研究。1948 年美国 Lobund 小组饲养的无菌鸡，成长后第一次 产卵，并孵化出新的一代，从此饲养无菌鸡获得完全的成功。由于 1922 年 Baeot 和 Harden 发现无菌蝇蛆必须饲喂 B 族维生素才能正常生 长，证明了无菌动物对 B 族维生素的需要，因为无菌动物
9、肠内没有细菌存在，自 身不能合成B族维生素，从而找到了过去的饲养无菌动物失败的原因。1937年 Balzam在无菌鸡的维生素B族缺乏症及在鸡体内能否合成B族维生素的研究中, 更加清楚地证明了这个问题。无菌动物对B族维生素需要的发现是很有价值的， 它推动了无菌动物培养工作的发展，并使之走向成功。第一个无菌大白鼠群是美国 Lobund 小组于 1951 年建立的。第二个无菌大白 鼠群是 Gustafsson 于 1956 年在瑞典建成。 1959 年 Reyniers 在 Tempa 大学建立 无菌动物实验室。印度的无菌动物群于 1959年在印度大学医学中心建立。随着无菌动物研究的开展，无菌动物的
10、饲养装置也不断地改进。 1915 年德 国的科斯特首次创造无菌动物培育隔离器。 1928 年美国圣母大学细菌学实验室 的 Reyniers 创造了不锈钢制的无菌动物大型隔离器。从此开展了无菌动物的系 统实验。现在美国有 48 个无菌动物研究单位，仅国立卫生研究院的 5 个研究所 里，就分别设有无菌动物研究室。 1930 年 Gustafsson 设计了第二型隔离器，整 个隔离器的原料是不锈钢的。在日本，自1946 年开始培育无菌动物， 1959年宫 川用不锈钢做隔离器的主体部分，并附有小的玻璃观察窗和灵敏的机械手，使不 锈钢隔离器达到比较完善的地步。但这种隔离器既笨重造价又昂贵，不可能大量 推
11、广使用，因而也限制了无菌动物工作的开展。在日本现有 24 个单位从事无菌 动物研究工作，仅在东京就有 9个无菌动物研究单位。 50年代，发明了用过氧 乙酸进行表面灭菌的方法以后， 1957年 P.C.Trexler 在美国印第安那州圣母大 学 Lobund 研究室里创造了塑料膜隔离器，用无毒聚氯乙烯薄膜制造隔离器的主 体部分。由于这类隔离器制作方便，既轻便又实用，所需用费用又不高，仅为不 锈钢隔离器的几十分之一，灭菌方法也大为简便，因此日渐广泛地得到应用，促 进了无菌动物研究的发展。1978 年 Lobund 研究室的 Morris Pollard 博士来华讲学时给我国赠送了一 具 Trexl
12、er 隔离器，中国医科院动物中心已仿制成功，上海、苏州等地也已制作 成功，并已小批量生产。近二年来， Trexler 教授亲自来华讲学，传授隔离器和 无菌动物饲养繁殖技术，促进了我国无菌动物研究的发展。现在北京、上海等地 已有几个单位在研究无菌动物。此外，澳大利亚、比利时、西德、苏联、捷克、英国、法国、意大利等国和 地区，都已建立了包括无菌动物在内的实验动物中心。对无菌动物的研究最初只是为了探讨高等动物与体内微生物之间的关系。 19 世纪末,Nattal氏及Thierfelder氏用剖腹术取出了妊娠豚鼠的胎儿，在无菌环 境下饲养了 10天。随后， Schettelus 发现鸡的胚胎是无菌的，后
13、来成功地进行 了雏鸡的无菌化。无菌动物所具有的独特优越性使其成为一种新型的实验动物。 随着生物学的进步和技术的发展，试行了各种动物的无菌化，现在无菌动物的品 种已经很多，不仅小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等小动物已有无菌动物，而且狗、猫、 猴、猪、山羊、绵羊和牛等大动物以及鸡、火鸡、鹌鹑、青蛙、蛇甚至蚕、苍蝇、 白蚁等也都有了无菌动物。这些都是为了适应科学发展的需要而培育的，其中的 小鼠、大鼠、豚鼠，国外一些发达国家已能大量生产，并比较方便地应用于日常 研究中了。已育成的无菌动物见表 6-2。表 6-2 已育成的无菌动物种类培育者及育成时间小鼠Pleasa nt s,1959大鼠Reyniers 等，
14、1946:Gustafsson,1948;Pleasants,1959豚鼠Miyakawa 等，1958;Tanami,1959;Pnillips 等，1959;Horton 和Hickey,1961;Newton 和 Dewitt,1961兔Wostmann 和 Pleasants,1959;Luckey,1963狗Glimsedt, 1946猫Bleby,1969山羊、绵羊Smi th,1961,1966猪Whitenair,等,1960马驹Drummond 等，1973猴Reyniers,1942鸡Reyniers,1943鹌鹑Woodard 等,1965;Miles,1966三、无菌动
15、物的特征只要饲料配备适当，无菌动物发育正常，外观和 普通动物相同，但是其机能、结构和普通动物有很大的不同。无菌动物受两个因 素影响，即微生物和因饲养比较聚集而致的肾上腺增大。无菌动物的特征主要反映在下面二个方面（一）形态学改变1消化系统：主要变化在肠道无菌动物肠道肌层薄，更为特异的是盲肠肥 大，比普通动物要大5-6 倍。无菌豚鼠的盲肠可达体重的1/3。主要是由于肠壁 薄、张力低而增大。由于盲肠膨大，肠壁菲薄，常因盲肠扭转或肠壁破裂而死亡。 如给无菌动物注入梭状芽孢杆菌则可缩小盲肠体积。肠粘膜绒毛增多。肝脏重量下降。2循环系统：心脏相对缩小。3血液系统：白细胞增加。普通动物白细胞总 数波动范围大
16、，无菌动物白细胞数值恒定。4网状内皮系统：脾脏缩小，无三级滤泡，网 状内皮细胞功能降低。（二）生理学改变1免疫功能：由于网状内皮系统、淋巴组织发 育不良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生丙种球蛋白的能力很弱（在检查无菌动 物的无菌性时，血清丙种球蛋白阴性可以作为无菌的一个辅助证据），又因为体 内无微生物和寄生虫，血中无抗体，血清杀菌力低，吞噬细胞噬菌力也低，因此 对微生物感染异常敏感，某些病原性弱和必须经腹腔或颅脑接种才能感染普通动 物的微生物很容易感染无菌动物。2生长率：无菌条件下对不同种属影响不同。 无菌鸟类生长率高于同种的普通鸟类；无菌大小鼠与普通鼠差不多；无菌豚鼠和 无菌兔生长率比普通者慢。因肠内无菌，不能帮助消化纤维素以提供机体所需要
