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1、淋巴细胞提取一 实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二实验对象：B / C小鼠三 实验器材：1试剂：淋巴细胞分离液、1640 培养基2.器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射 器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液 管、加样枪、离心机）、 75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、 超净台四 实验步骤：1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠 脾脏。注意无菌操作。3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使
2、用前摇匀淋巴细胞分离液）。 用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进 入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨 过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200ML的1640培 养基。5、800g 离心 30 分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第 三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示104flUUEZS 说碑片图二左:EZ-Sep Mouse IX 分离小 竄脾脏细胞的
3、分层示意图。即便死亡细 胞和细胞碎片很釦也不影响淋巴细胞的分层：图二右:普通小鼠淋巴细胞分离液在死 亡细胞和细胞碎片过參时,不能形成淋 巴细胞层戶6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。顷倒上清液，加入3-5mLLympho-SpotTM 无血清培养基重悬，细胞计数。五、注意事项： 离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又 有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2M1足矣。 如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把 脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中
4、。否则，液体 挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加 1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下 移。 推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死 亡。脾淋巴细胞的制备将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露 腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织(此步 可省略)；将脾脏移入200目铜
5、网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻 刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS,并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴 细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心1020min ；收集界面上的细胞(白色云 雾层)，放入89mL盛有Hank溶液的离心管中，混匀后，以15002000rpm离心510min；吸去上清液，沉淀经反复洗 涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-5x10*6个/mL；铺板，将细胞悬液加 到96孔细胞板中，10
6、0pL/孔。如何从小鼠的脾脏中提取T淋巴细胞?越详细越好，最好有每一步的具体操作步骤 枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响摘要目的：研究枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)对荷瘤小鼠体内 肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞(dendritic cells, DCs )的影响，探讨LBP对荷 瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤 重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞(tumor拟in filtrating lymphocyte, TIL)中T 淋巴细胞亚群和DCs的数量，以
7、及协同刺激分子CD80 (B7拟1)表达的变化。结果:LBP 可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+ 和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(Pv0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量 及B7 1表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢 复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿 瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。关键词枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞Effects of Lyci
8、um barbarum polysaccharide on tumor microenvironment T 拟 lymphocyte subsets and dendritic cells in H22 拟 bearing miceHE Yan 拟 Li, YING Yi, XU Yan拟 Li, SU Jun 拟 Fang, LUO Hui, WANG Hui拟 Feng(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 5
9、10405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First Peoples Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment T 拟 lymphocyte subsets and dendritic cells in H22 拟 bearing mice
10、and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22 拟 bearing mice were given LBP orally for two weeks. T 拟 lymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumor 拟 infiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could signifi
11、cantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P35%；W型胶原酶和I型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离 液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) 标记的抗小鼠CD4、CD80 (B7拟1)单克隆抗体，藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的抗 小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日
12、本岛津公司产品； FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。1.2 实验动物及分组 昆明种小鼠 60 只，随机分成 4 组：正常组、模型组、 LBP 低剂量 组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2x106个H22肿瘤 细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据 文献结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 gkg拟1d拟1及1.25 gkg拟1d拟1灌 胃(均用生理盐水稀释成0.5 ml/d)，连续灌胃14 d。1.3LBP 体内抑瘤率的测定 每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15 天小鼠眼球
