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1、重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一.实验目的.检查重组质粒的插入片段的大小2.学习PR技术的使用二.实验原理（一)重组质粒酶切鉴定将具有外源NA的转化子的EoliDH5菌株进行培养,并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。（二）CRPCR(Polymerase ChainReation)即聚合酶链式反映是1986 年由Kllis Mulls发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域,它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析,还可用于突变体和重组体的构建，基因体现调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过
2、学习和掌握PCR反映的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。1聚合酶链式反映原理R是一种运用两种与相反链杂交并附着于靶DA两侧的寡核苷酸引物,经酶促合成特异的DNA片段的体外措施。反映过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反映构成一种循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DA聚合酶在72将单核苷酸从引物端开始掺入,沿模板3方向延伸，合成DA 新链。由于每一循环所产生的NA均能成为下一次循环的模板，因此CR产物以指数方式增长，经530次周期之后,理论上
3、可增长109倍,事实上可增长0倍。PCR 技术具有操作简便、省时、敏捷度高特异性强和对原始材料质量规定低等长处，但由于所用的aqDNA 聚合酶缺少53核酶外切酶活性,不能纠正反映中发生的错误核苷酸掺入,估计每900个核苷酸会导致一种掺入错误,但是错误掺入的碱基有终结链延伸的作用倾向,使得错误不会扩大。2 CR的反映动力学PR技术类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反映环节构成：模板NA的变性:模板N经加热至3左右一定期间后，使模板DNA双链或经PC扩增形成的双链NA解离,使之成为单链，以便它与引物结合,为下轮反映作准备；模板
4、DNA与引物的退火（复性):模板NA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板N单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DA模板引物结合物在TaqA聚合酶的作用下，以TP为反映原料，靶序列为模板,按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链反复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保存复制链”，并且这种新链又可成为下次循环的模板。每完毕一种循环需2分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。达到平台期(Plateu)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。CR的三个反映环节反复进行，使NA扩增量呈指数上升。反映最后的DN扩增量可用Y=(+X)n计算。Y
5、代表DA片段扩增后的拷贝数,X表达平（Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反映中平均效率达不到理论值。反映初期,靶序列DN片段的增长呈指数形式,随着CR产物的逐渐积累,被扩增的DA片段不再呈指数增长，而进入线性增长期或静止期,即浮现“停滞效应”,这种效应称平台期数、C扩增效率及DNA聚合酶P的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数状况下,平台期的到来是不可避免的。3 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不同样而形成的，以一
6、种原始模板为例，在第一种反映周期中,以两条互补的NA为模板,引物是从3端开始延伸,其5端是固定的，3端则没有固定的止点,长短不一，这就是长产物片段。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链（即长产物片段)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。短产物片段是按指数倍数增长，而长产物片段则以算术倍数增长，几乎可以忽视不计。这使得PR的反映产物不需要再纯化,就能保证足够纯D片段供分析与检测用。三.实验材料及仪器1.实验材料:扩增仪,琼脂糖凝胶电泳设备，
7、移液器，0.ml薄壁C管,凝胶成像仪 ,模板pU1重组质粒（插入片段125p和54bp）,寡核苷酸引物(上游引物M13F,下游引物M1R），DA聚合酶（TKa，-0贮存），Ps(TaKaa，-20贮存）,PCR反映缓冲液（aKa，0贮存) 高速离心机,电泳仪，制胶槽，电泳槽,梳子,锥形瓶,量筒,移液枪,冰盒，枪尖，Eppendrf管，微量移液器,手套,记号笔,TE电泳缓冲液(10),琼脂糖，溴化乙锭(EB)， N相对分子质量原则物DNAMarer kHind,500四.实验环节（一）重组质粒的酶切、电泳检测1对于电泳显示插入片段在20k以上的重组质粒,采用in酶切进行验证。大片段或高产量的重组
8、质粒推荐的反映体系(10体系）如下:成分体积（l）d H2O6.210Bufer（含Mg2）1.Re-Puc2.0Hind(15U/l）.8合计10若插入片段比较小,则选用2体系:成分体积（l)dd O.11.01ufe(含Mg2+）2.0RePu196.0-8.Hind（15U）.合计2.0轻弹混匀后，短暂离心,于7 孵育2hr后,保存于 -2,备电泳检测。2. 酶切产物电泳检测取酶切产物10 l,加入2 u 6上样缓冲液,混匀后取6ul点样。 取重组质粒1u,加入2 l 6上样缓冲液，混匀后取6 ul点样。以 DAndII为arker。10V恒压电泳约0min。电泳结束EB染色10mi，水
9、洗后紫外灯下观测实验成果。（二)重组质粒的CR验证PC扩增目的基因对于电泳显示插入片段在2.b如下的重组质粒，采用PC进行验证。引物本次重组用到的载体是pUC1,限制性内切酶为Hi ,因此选择Hind 酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。由于载体pUC1上两引物间序列的长度是150bp,因此CR扩增产物的长度(bp）=150插入片段的长度。下图所示为pU1部分序列,即引物来源：M13F(-）: cocgccaggttttcccagtcaccgttgTaaacgcggccagtgattcgatccccggactctagagtcgacctgcacatgcaagttggcgtaagtcatagctg
10、tgggaagtttccgt id 3(-8)（互补链)PR引物为引物名称引物序列5 3引物长度(es)T()13F(-47)CCCAGGGTTTTCGTACGA2464.7M3(-48)GACGGATAAATTTAAGG2.9.反映体系的建立P反映体系如下:编号组分体积（l)1dd H14210Bufe(含Mg2+)2.dNTP(2.5 m eac）164M13F(10M）0.85M1R(10)0.86模板（约10ng/l）1.7Taq酶（5) .2总体积200除了此反映体系之外，还要做三个反映体系:其她组分不变,只将编号的组分换成共用64bp模板，pUC1质粒（作为模板对照），ddH2（作
11、为阴性对照)。振荡混匀，然后短暂离心。 反映程序的设定将加好样的CR管进行标记，放入PCR仪中,设定反映基本参数如表所示。编号项目温度/ 时间1预变性3min2变性90s3复性5830s延伸转2，循环次5终延伸7210min6保存4（1） 预变性:让DNA双链充足解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这重要是为了保险起见,使模板DA的二级构造充足打开。（2） 变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DN。（3） 复性：当温度忽然减少时由于模板分子构造较引物要复杂的多,并且反映体系中引物DNA量大大多于模板NA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链,而模板NA
12、双链之间互补的机会较少。（4） 延伸:在DN聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下, 5-3的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反映。（5） 终延伸：循环完毕后 使PCR反映完全以提高扩增产量,在用一般aq酶进行CR扩增时在产物末端加尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行3. PCR产物检测:1%的琼脂糖凝胶电泳：20uCR产物中加3.ul 10上样缓冲液，混合均匀,取5u 点样。以Dps为Marker。100V恒压电泳约40min。电泳结束EB染色0mi,水洗后紫外灯下观测实验成果。五.实验成果及分析（一） 重组质粒的酶切电泳成果将重组质粒酶切之后进行凝胶电泳,紫外成像如图
13、1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21图1 第1-5组重组质粒酶切凝胶电泳成像图从左到右各泳道分别为:第泳道： DNAHindII；第2-1泳道:第15组重组与酶切质粒(R，R1/iIII,R2，R2/HndIII)；第0泳道:UC9/HndII;第1泳道: DN/HindII。我所在的组别是第1组，样品在第泳道。第2、泳道分别为重组质粒1和重组质粒的酶切,具体分析见图2。第4、泳道分别为重组质粒2和重组质粒2的酶切,具体分析见图3 。如图2所示。泳道1为 DNA/HindIII，泳道20为pUC19/HindIII，泳道2为本组重组质粒样品1，泳道3为重组质粒的酶切。带（1）大小在5000-6000bp左右，与第2泳道中的重组质粒位置近似，因此带（1）可以理解为未被酶切开的重组质粒；带（2）大小4000左右，与第2泳道中重组质粒前面的那条带近似，但却变得暗了，可以判断为未被酶切的重组质粒，也阐明泳道2中最前面的那条带为外源DNA重组质粒。带（3）大小与酶切pUC19质粒大小相似，可以判断为重组质粒酶切
