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1、消毒剂的选用原则：目的：确认各洁净级别的操作间及设备外表面按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒、防止污染的目的，并在消毒剂有效期内能确保其消毒效力能符合要求。范围：本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。1.参考文件1.1.医疗器械生产质量管理规范1.2.中国药典2023版 第4部 微生物限度检查法2.概述2.1.本公司的洁净区为D级，拟定用于洁净区表面消毒的有五种消毒剂：75%乙醇、0.1%新洁尔灭溶液、0.2%新洁尔灭溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液。本次验证方案将选用以上5种消毒剂
2、分别进行验证试验。作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。在利用消毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒的不少于5分钟。消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期序号名称消毒对象消毒方法有效期175%乙醇用于设备表面、器具和手消毒。采用擦拭或喷洒方式密闭保存D级：30天20.1%新洁尔灭溶液用于地面、墙面、器具、工作服、清洁布、拖布和洁净鞋的消毒采用擦拭或浸泡方式密闭保存D级：30天30.2%的新洁尔灭溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密闭保存D级：30天40.5%醋酸氯己定溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密闭保存D级：30天50.
3、1%醋酸氯己定溶液用于工作服、清洁布、拖布和洁净鞋的消毒采用浸泡方式密闭保存D级：30天2.2.为了确认消毒剂的消毒效力，通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。其中，用定量悬浮试验法和表面实验法进行实验室考察试验部分。洁净区设施表面材质基本都是不锈钢和玻璃两种，故表面试验法选用不锈钢载片和玻璃裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验。两种试验方法作用的消毒剂见表。序号试验方法消毒剂1表面实验法75%乙醇20.1%新洁尔灭溶液3定量悬浮试验法0.3%的新洁尔灭溶液40.1%新洁尔灭溶液50.5%醋酸氯己定溶液60.1%醋酸氯己定溶液现场考察试验部分选择车间(D级)的配液间、灌装间设备表面消毒前
4、和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。3.确认前准备3.1.验证用试剂与材料3.1.1.菌种序号名称序列号1金黄色葡萄球菌CMCC(B)260032大肠埃希菌CMCC(B)441023枯草杆菌芽孢CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F) 98001 3.1.2.培养基序号名称备注1营养琼脂培养基培养基经121，20min灭菌备用2营养肉汤培养基3胰酪大豆胨琼脂培养基4胰酪大豆胨培养基5大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟（编号：BZW12085）规格：f55mm，取样面积为25m26玫瑰红钠琼脂培养接触碟（编号：BZW15129）3.1.3.序号消毒剂名称中和剂备注175%乙醇1%卵磷脂 +0
5、.1%聚山梨酯80中和剂经121，20min灭菌备用。20.1%新洁尔灭溶液30.2%的新洁尔灭溶液消毒液拟定选用的中和剂3.1.4.稀释液0.9%无菌氯化钠溶液（NS）3.1.5.器具及设备序号名称1无菌移液管2锥形瓶3无菌试管4恒温水浴锅5恒温恒湿培养箱6恒温恒湿培养箱3.2.验证用试剂与材料记录见附录1。4.消毒剂消毒效力试验4.1.中和剂鉴定试验4.1.1.试验目的通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌剂及其恢复期培养示范有害或不良影响。4.1.2.菌液的制备及计数4.1.2.1.金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌工作菌液的制备接种金黄色葡萄球菌
6、、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，3035培养1824小时。取上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成11085108CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为11085108CFU/ml，可不再用0.9无菌氯化钠溶液稀释）。计数时，将11085108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用营养琼脂培养基3035培养2天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。4.1.2.2.白色念珠菌工作菌液的制备接种白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，2328培养2448小时。取上述培养物用0.
7、9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成11085108CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为11085108CFU/ml，可不再用0.9无菌氯化钠溶液稀释）。计数时，将11085108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用改良马丁琼脂培养基2328培养3天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。4.1.3.鉴定试验操作4.1.3.1.配制75%乙醇、0.1%新洁尔灭溶液、0.2%新洁尔灭溶液、40mg/L的二氧化氯、60mg/L的二氧化氯，具体操作执行清洁剂和消毒剂管理。将配置好的消毒剂置201恒温水浴锅中备用。4.1.
8、3.2.分组操作试验分组及稀释操作方法简表组号混合液A混匀作用10min混合液B混匀作用10min取混合液B或混合液B的稀释级溶液0.5ml平板计数（2皿/组）取0.5ml工作菌液加入下列溶液中取混合液A 0.5ml加入下列溶液1消毒剂4.5ml稀释液4.5ml混合液B、10-12消毒剂4.5ml中和剂4.5ml混合液B、10-13中和剂4.5ml稀释液4.5ml10-2、10-34中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为1:1）稀释液4.5ml10-2、0-35稀释液4.5ml稀释液4.5ml10-2、10-36稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。具体操作l 第1组目的：观
9、察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。操作：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取0.5ml注皿，平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置2328培养5天计数计数。l 第2组目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。操作：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml +中和剂4.5ml，混匀作用10min，用稀释液稀释成10-1。分别取未稀释溶液（混合液0.5
10、mll+中和剂4.5ml的混合液）及10-1 0.5ml注皿，各平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于2328培养5天计数。l 第3组目的：观察中和剂是否有抑菌性操作：取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼
11、脂培养基，倒置3035培养3天计数计数。l 第4组目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。操作：取消毒剂和中和剂1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置3035培养3天计。l 第5组目的：作菌落数对照用操作：取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用
12、10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置3035培养3天计数。l 第6组目的：作为阴性对照用操作：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。4.1.3.3.结果判断试验结果应符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。l 第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。l 第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合
13、下表要求第1组平板平均菌落数第2组平板平均菌落数05x(x+5)y(y+0.5y)l 第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%。计算公式如下：（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和误差率10033组间菌落平均数l 第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。4.1.4.中和剂鉴定试验记录见附录2。4.2.定量悬浮试验4.2.1.试验目的由于0.2%的新洁尔灭溶液、0.1%新洁尔灭溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液是通过浸泡或液封消毒，通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。4.2.2.试验操作4.2.
14、2.1.配制0.2%的新洁尔灭溶液、0.1%新洁尔灭溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液，操作执行清洁剂和消毒剂管理。将配置好的消毒剂置201恒温水浴锅中备用。4.2.2.2.由于0.2%的新洁尔灭溶液、0.1%新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。4.2.2.3.将菌液制备成11085108CFU/ml的工作菌液，菌液的制备及计数同。4.2.2.4.将试管按需要分组排列在试管架上，试验组分3组（4min、5min、6min各一组），并由左向右逐管标明消毒剂、中和剂、10-1、10-2。对照组分1组，并由左向右逐管标明稀释液、中和剂、10-1、10-2、10-3、10-4。4.2.2.5.向个试管加入4.5
